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文檔簡介
1、由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)所導致的艾滋病是目前最具有威脅性的傳染病之一。雖然高效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly activeanti-retroviral therapy, HAART)能有效的抑制HIV病毒的復制并使病毒載量降低至檢測下限,但是由于HIV潛伏庫的存在,導致HIV不能被徹底清除,因此當前HIV潛伏庫被認為是從體內(nèi)徹底清除HIV的最后壁壘。HIV潛伏狀態(tài)本質(zhì)上是
2、一種可逆的轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài),這種狀態(tài)的產(chǎn)生和維持涉及多種宿主轉(zhuǎn)錄抑制因子及表觀修飾復合體。結(jié)合在HIV前病毒基因組長末端重復序列5'LTR(long terminalrepeat)上的宿主轉(zhuǎn)錄抑制因子及其募集的組蛋白脫乙?;窰DACs(histonedeacetylase)等表觀修飾復合體在HIV的轉(zhuǎn)錄沉默和潛伏的建立維持中起著重要作用。視網(wǎng)膜母細胞瘤結(jié)合蛋白RBBP4(retinoblastoma binding protein4),作
3、為組蛋白分子伴侶,通過與HDACs等表觀修飾復合體協(xié)同作用,可參與基因的轉(zhuǎn)錄沉默。但作為與HDACs密切關聯(lián)的RBBP4分子,它在HIV的轉(zhuǎn)錄以及潛伏中的作用還未見報道。因此,本文將對RBBP4在HIV轉(zhuǎn)錄和潛伏中的作用及機制進行研究。
目的:
1.研究RBBP4在正常對照者、臨床HIV感染者和治療者外周血單個核細胞PBMC(peripheral blood mononuclear cells)中的表達變化,并在實驗
4、室HIV感染的CEM-ss和TZM-bl細胞模型上對RBBP4的表達變化進行驗證;
2.研究RBBP4表達的改變對HIV產(chǎn)生的作用,并在HIV的轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)研究RBBP4對HIV LTR介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及RBBP4與HIV LTR啟動子的結(jié)合;
3.進一步在HIV的感染和潛伏模型中研究RBBP4對HIV轉(zhuǎn)錄和潛伏作用的機制,為HIV潛伏庫的清除提供實驗數(shù)據(jù)及科學依據(jù)。
方法:
1.首先利用熒光定量PC
5、R檢測RBBP4分子在臨床HIV感染者(30例)、HIV治療者(30例)和健康對照(30例)的PBMCs中的表達變化。并在實驗室HIV感染的CEM-ss和TZM-bl細胞模型上,利用熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光技術,對RBBP4的表達變化進行定性和定量檢測。
2.通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測HIV LTR啟動轉(zhuǎn)錄的螢火蟲熒光素酶活性,來研究RBBP4對HIV LTR啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;利用凝膠遷移實驗(ele
6、ctrophoreticmobility shift assay, EMSA)研究RBBP4與HIV LTR上NF-κB(-115~-75)和NR2F1(-345~-319)結(jié)合位點的結(jié)合。
3.在293T細胞與pNL4-3轉(zhuǎn)染的細胞模型中,利用染色質(zhì)免疫共沉淀(chrmatin immunoprecipitation analysis,ChIP)研究RBBP4對HDAC1/2和NR2F1在LTR上結(jié)合的影響,并在HIV潛伏和
7、激活的CEM-Bru細胞中研究RBBP4、HDAC1、HDAC2和NR2F1在LTR上的結(jié)合變化。
結(jié)果:
1.發(fā)現(xiàn)RBBP4在臨床HIV感染者中的表達明顯高于HIV治療成功者和正常對照(P<0.01;P<0.01);在實驗室HIV感染的CEM-ss和TZM-bl細胞模型中,RBBP4 mRNA和蛋白的表達均明顯高于未感染的對照細胞,其結(jié)果與臨床發(fā)現(xiàn)一致;并進一步發(fā)現(xiàn)在CEM-ss和TZM-bl細胞模型中將RBBP4
8、干擾表達后再感染HIV,發(fā)現(xiàn)HIV病毒顆粒的產(chǎn)生明顯增加;
2.過表達RBBP4可減少上清HIV病毒顆粒、病毒載量、單間接轉(zhuǎn)錄本、多剪接轉(zhuǎn)錄本和未剪接轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生;進一步的研究發(fā)現(xiàn)RBBP4可抑制HIV LTR啟動的本底轉(zhuǎn)錄以及NF-κB和Tat誘導的轉(zhuǎn)錄;RBBP4可分別與HIV LTR(-454~+181)上的NF-κB結(jié)合位點(-115~-75)和NR2F1結(jié)合位點(-345~-319)結(jié)合。
3.RBBP4在
9、HIV LTR上結(jié)合的變化能影響NR2F1、HDAC1/2在LTR上結(jié)合,即RBBP4在HIV LTR上的結(jié)合增加,NR2F1、HDAC1/2在LTR上的結(jié)合也增加,組蛋白乙?;浇档?,最后導致HIV上清P24和病毒顆粒的產(chǎn)生減少;在HIV潛伏的CEM-Bru細胞中,RBBP4、NR2F1、HDAC1/2在HIV LTR的結(jié)合明顯高于在激活狀態(tài)下的結(jié)合;在潛伏細胞中將RBBP4干擾表達后能促使HIV起始轉(zhuǎn)錄本增加。
結(jié)論:<
10、br> 1.首次發(fā)現(xiàn)RBBP4在未經(jīng)治療的HIV感染者中表達升高,并在HIV感染的TZM-bl和CEM-ss細胞中發(fā)現(xiàn)RBBP4的表達升高,表明HIV感染可誘導RBBP4表達增加;
2.RBBP4可抑制HIV LTR介導的本底轉(zhuǎn)錄;RBBP4可抑制由NF-κB和Tat誘導激活的HIV LTR轉(zhuǎn)錄;并能與LTR上的NF-κB結(jié)合位點(-115~-75)和NR2F1結(jié)合位點(-345~-319)結(jié)合;
3.RBBP4通
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