2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、【背景】
  胃癌是是最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在世界范圍內(nèi)位于惡性腫瘤的第二位。隨著醫(yī)學研究的不斷進步和發(fā)展,胃癌的治療方法和策略也得到不斷完善,但化療仍然是胃癌治療的主要手段之一。而多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的出現(xiàn),往往使得化療失敗,導致胃癌患者預后較差,5年生存率不足40%。因此,闡明胃癌多藥耐藥的機制勢在必行。國內(nèi)外學者,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的胃癌多藥耐藥相關基因和分子。我們實驗室也建立了胃

2、癌耐藥細胞亞系,并應用抑制消減雜交、差異顯示PCR、部分隨機siRNA文庫和miRNA芯片等策略,成功篩選并鑒定出一系列耐藥相關的基因和miRNA。但由于胃癌的耐藥機制非常復雜,這些結果尚不能完全闡明胃癌多藥耐藥的本質。因此,采用新策略繼續(xù)深入研究胃癌多藥耐藥機制具有非常重要的意義。
  轉錄因子是一類重要的基因調(diào)控分子,參與多種細胞生物學過程,如:細胞分化、增殖、凋亡、細胞周期進展和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。近年來,轉錄因子在多藥耐藥中的

3、作用逐漸得到公認。新近出現(xiàn)的轉錄因子活性譜芯片(oligonucleotide array-based transcription factor assay,OATFA),為體外研究轉錄因子DNA結合活性提供了新的思路和策略。我們課題組前期利用此芯片,在胃癌阿霉素耐藥細胞SGC7901/ADR和親本細胞SGC7901中篩選出差異表達的轉錄因子,其中CUTL1差異最明顯,推測CUTL1有可能參與胃癌多藥耐藥。
  CUTL1,屬于轉

4、錄因子同源結構域家族,其在進化上高度保守。CUTL1的表達水平和活性受到廣泛的調(diào)節(jié),包括轉錄起始的改變,蛋白酶解加工,磷酸化和乙?;?,并且這些調(diào)節(jié)均通過對細胞周期的調(diào)控發(fā)揮作用。同時,CUTL1可以通過轉錄激活或轉錄抑制的方式,調(diào)節(jié)基因的表達,從而參與多種細胞生物學功能,如細胞分化、細胞增殖、細胞周期進展、細胞遷移和侵襲等。文獻報道,CUTL1可以通過抑制凋亡而促進胰腺癌多藥耐藥的發(fā)生。因此,我們認為深入研究轉錄因子CUTL1在胃癌多

5、藥耐藥中的作用和機制,具有非常重要的意義,有可能為臨床逆轉多藥耐藥提供新的思路和靶標。
  【目的】
  從多水平多角度研究轉錄因子CUTL1在胃癌多藥耐藥中的作用,并初步探討其可能的分子機制。
  【方法】
  1、利用MTT方法檢測脫藥培養(yǎng)2周的胃癌阿霉素耐藥細胞、給藥培養(yǎng)的耐藥細胞和親本細胞對化療藥物的敏感性;
  2、PCR、Western blot和EMSA實驗檢測SGC7901/ADR細胞和SG

6、C7901細胞中CUTL1的表達量和DNA結合活性;
  3、收集新鮮的胃癌活檢組織標本,利用EMSA檢測胃癌組織標本中CUTL1的結合活性,利用組織培養(yǎng)藥物敏感性檢測技術判斷新鮮胃癌組織標本對化療藥物的敏感性,結合兩者,從組織水平分析CUTL1活性與藥物敏感性的相關性;
  4、擴增和鑒定 CUTL1正義和反義載體,并分別感染和轉染SGC7901/ADR和SGC7901細胞,通過RT-PCR和Western blot檢測感

7、染和轉染后細胞中CUTL1的表達量;
  5、MTT方法檢測感染和轉染后細胞對常見化療藥物的敏感性;
  6、通過流式細胞術分析 CUTL1對胃癌細胞凋亡的影響;
  7、建立裸鼠成瘤模型,進一步在體內(nèi)證實 CUTL1對藥物敏感性的影響;
  8、通過報告基因實驗、qPCR、Western blot和MTT等方法對CUTL1的靶基因BMP6進行功能驗證,以初步探討CUTL1參與胃癌多藥耐藥的可能分子機制。

8、  【結果】
  1、轉錄因子CUTL1在胃癌耐藥細胞中的表達量和活性降低
  我們分別給藥培養(yǎng)和脫藥培養(yǎng)2周阿霉素耐藥胃癌細胞SGC7901/ADR,然后利用MTT方法檢測其對化療藥物的敏感性,結果顯示,脫藥培養(yǎng)2周后,SGC7901/ADR與給藥培養(yǎng)的細胞對化療藥物的敏感性無明顯差別,而二者均明顯低于SGC7901的藥物敏感性。
  我們利用RT-PCR、Western blot和EMSA方法檢測SGC7901/A

9、DR和SGC7901細胞中CUTL1的表達量和表達活性,結果顯示,SGC7901/ADR細胞中CUTL1的表達量和表達活性均明顯低于SGC7901細胞,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
  2、CUTL1活性與胃癌組織的多藥耐藥性呈負相關
  我們利用EMSA實驗檢測33例新鮮胃癌組織標本中CUTL1的活性,以滯后條帶灰度值的平均值為準,其中16例被納入CUTL1高活性組,17例納入CUTL1低活性組。HDRA對33例胃癌組

10、織標本對化療藥物的敏感性進行檢測,以抑制率大于50%為標準,結果顯示,17例標本對化療藥物呈內(nèi)源性的耐藥,而且其中13例的CUTL1活性較低,提示CUTL1高活性組中的抑制率明顯高于 CUTL1低活性組,p<0.05,具有統(tǒng)計學意義,可見CUTL1活性與胃癌組織的多藥耐藥性呈負相關。
  3、CUTL1在胃癌細胞多藥耐藥中的作用
  我們成功擴增了CUTL1正義和反義載體,并分別感染和轉染SGC7901/ADR細胞和SGC7

11、901/MKN45細胞,分別命名為:SGC7901/ADR-CUTL1,SGC7901/ADR-VC,SGC7901-shRNA和SGC7901-VC,MKN45-shRNA和MKN45-VC。RT-PCR、Western blot結果均提示 CUTL1在 SGC7901/MKN45-shRNA中的表達明顯低于SGC7901-VC,MTT結果提示SGC7901-shRNA對多種化療藥物的敏感性明顯低于SGC7901-VC. CUTL1在

12、SGC7901/ADR-CUTL1中的表達明顯高于SGC7901/ADR-VC,其對藥物的敏感性也高于SGC7901/ADR-VC。
  Annexin V/PI染色法檢測細胞受藥物誘導調(diào)亡的變化,發(fā)現(xiàn)上調(diào)CUTL1表達能夠明顯增加 SGC7901/ADR細胞對ADR的藥物敏感性,降低 CUTL1表達能夠明顯降低 SGC7901/MKN45細胞對ADR的藥物敏感性。SGC7901/ADR-CUTL1成瘤后,給予化療藥物,腫瘤的抑制

13、率明顯高于SGC7901/ADR-VC組,而 SGC7901-shRNA組的腫瘤抑制率低于SGC7901-VC。
  4、CUTL1可能通過BMP6參與胃癌多藥耐藥
  CUTL1可以抑制BMP6的表達,并且CUTL1可以與BMP6啟動子結合并抑制其轉錄。siRNA阻斷BMP6的表達后,可以增強CUTL1呈低表達的胃癌耐藥細胞對化療藥物的敏感性,部分逆轉胃癌耐藥細胞的多藥耐藥表型。因此,CUTL1可能通過調(diào)節(jié)BMP6而參與胃

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