PKCa-JNK信號通路在乳腺癌多藥耐藥中的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　 內(nèi)分泌治療在乳腺癌的綜合治療中占有重要地位,它是通過降低和清除體內(nèi)雌激素水平,阻止腫瘤的生長繁殖,達(dá)到抗腫瘤作用。但多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)的出現(xiàn)給乳腺癌的內(nèi)分泌治療帶來了困難。以往研究表明,腫瘤耐藥的機制復(fù)雜,包括多個耐藥基因的表達(dá),腫瘤細(xì)胞自己合成生長因子或?qū)ιL因子發(fā)生反應(yīng),細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡功能的異常,PKC的活性異常等。本文旨在研究PKC在乳腺癌細(xì)胞凋亡中

2、所起的作用及與MDR的關(guān)系。
　　 實驗方法:
　　 (1)用Western Blot和RT-PCR檢測乳腺癌敏感型細(xì)胞株MCF-7和耐藥型細(xì)胞株MCF-7/ADR在PKCα、PKCδ、ER和p-gp以及耐藥基因mdrl表達(dá)的差異。
　　 (2)用MTT方法檢測tamoxifen(TAM)對兩個細(xì)胞株細(xì)胞活性的影響；臺盼藍(lán)拒染法檢測TAM對兩個細(xì)胞株細(xì)胞死亡率的影響；進一步用DNAladder方法證實TAM引起的

3、細(xì)胞死亡是凋亡,用FACS檢測tamoxifen引起細(xì)胞凋亡的凋亡率的差異；最后用Western Blot的方法研究TAM作用于細(xì)胞時PKCα、PKCδ、ERK和JNK磷酸化水平的變化。
　　 (3)用FACS和臺盼藍(lán)拒染法檢測加入PKCα和JNK抑制劑以后兩個細(xì)胞株的凋亡變化,并用Western Blot的方法檢測了在這個變化過程中PKCα和JNK的磷酸化變化及通過RT-PCR的方法檢測PKCα抑制劑對mdrl的影響。

4、　　 結(jié)果:
　　 (1)用Western blot方法檢測兩個細(xì)胞株在PKCα和PKCδ表達(dá)存在著相反的現(xiàn)象,MCF-7高表達(dá)PKCδ,其含量是MCF-7/ADR的三倍以上；而在MCF-7/ADR,則非常強烈的表達(dá)PKCα,是MCF-7細(xì)胞的7倍以上；用該方法檢測到p-gp在MCF-7/ADR中表達(dá)而在MCF-7細(xì)胞中不表達(dá)；ER的表達(dá)情況和p-gp相反。
　　 用RT-PCR的方法檢測兩個細(xì)胞株中耐藥基因mdrl的

5、表達(dá):MCF-7細(xì)胞不表達(dá)mdrl,而MCF-7/ADR細(xì)胞表達(dá)mdrl。
　　 (2)用MTT方法檢測TAM對細(xì)胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)5-30μM TAM使MCF-7細(xì)胞的活性由85.99％±0.69％降低到19.62％±3.35％,而對MCF-7/ADR細(xì)胞僅僅是由96.04％±0.36％降低到62.28％±4.21％。臺盼藍(lán)拒染實驗發(fā)現(xiàn)TAM明顯引起了MCF-7的細(xì)胞死亡,30μM TAM在12h可以引起細(xì)胞的全部死亡,而10

6、μM TAM作用24h引起了一半細(xì)胞的死亡；而在MCF-7/ADR只有當(dāng)TAM濃度提高到25μM時才可以看到明顯的細(xì)胞死亡,30μM TAM作用24h引起35.23％±1.98％的細(xì)胞死亡；用DNAladder方法研究發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞中DNA階梯的出現(xiàn)呈現(xiàn)時間依賴關(guān)系,而MCF-7/ADR細(xì)胞除了H2O2陽性對照組出現(xiàn)DNA階梯,其他各組均沒有階梯出現(xiàn)。用FACS方法研究發(fā)現(xiàn)兩個細(xì)胞株凋亡率存在著明顯的差異,10μM TAM引起的凋亡

7、率分別是49.82％±4.14％和14.52％±4.32％；20μM TAM引起的凋亡率是69.10％±2.09％和22.90％±3.58％；而30μM TAM引起的凋亡率分別是81.08％±4.67％和33.25％±2.10％。
　　 (3)用Western Blot方法研究發(fā)現(xiàn)10μM TAM作用1h-24h引起了MCF-7細(xì)胞PKCα磷酸化水平的增高,呈時間依賴性,而MCF-7/ADR處于飽和狀態(tài)。同時TAM激活了MCF-

8、7 PKCδ磷酸化,也呈時間依賴性；MCF-7/ADR呈微弱表達(dá)。TAM引起的ERK的磷酸化變化:在MCF-7細(xì)胞中,ERK的磷酸化水平漸增強,6h達(dá)最高,在12h又有所降低,24h又升高；而在MCF-7/ADR中,TAM對ERK無激活作用;TAM引起了MCF-7細(xì)胞的/NK磷酸化呈時間和濃度依賴性,而在MCF-7/ADR僅僅引起細(xì)胞JNK微弱的磷酸化。
　　 (4)PKCα抑制劑G(o)6976能增強TAM引起的細(xì)胞株凋亡和M

9、APK磷酸化水平:臺盼藍(lán)拒染法和FACS檢測在G(o)6976存在的情況下TAM對細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)G(o)6976可以提高TAM引起的細(xì)胞凋亡,在MCF-7/ADR中,與10μM、20μM和30μM TAM單獨處理組比較提升率分別達(dá)到19.1％、21.O％和17.9％；同時它單獨或和TAM聯(lián)合作用都能夠提高JNK的磷酸化水平。JNK的抑制劑sp600125抑制了MCF-7的凋亡,并且它僅僅能夠抑制JNK的磷酸化水平,對ERK、PKC

10、α磷酸化水平?jīng)]有影響。聯(lián)合應(yīng)用PKCα和JNK的抑制劑結(jié)果顯示:JNK的抑制劑sp600125能逆轉(zhuǎn)G(o)6976的作用,表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡率降低,JNK不能被磷酸化。
　　 (5)G(o)6976對耐藥蛋白的影響:Western Blot結(jié)果表明,G(o)6976對耐藥蛋白p-gp的表達(dá)沒有影響,RT-PCR結(jié)果顯示G(o)6976對耐藥基因MDRI的mRNA沒有影響。
　　 結(jié)論:
　　 (1)耐藥型細(xì)胞株MC

11、F-7/ADR高表PKCα和耐藥蛋白p-gp,低表達(dá)PKCδ,不表達(dá)ER,敏感型細(xì)胞株MCF-7則正好相反。
　　 (2)TAM引起MCF-7的細(xì)胞死亡是凋亡,其IC50是10μM；而MCF-7/ADR則表現(xiàn)出了對TAM的耐藥。在凋亡和耐藥這個過程中.()M誘導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞PKCα和PKCδ高度磷酸化,同時也引起了E()K的磷酸化；在MCF-7/ADR細(xì)胞中,PKCα磷酸化過飽和,TAM不能影響其活性；TAM不能激活PKCδ