應用反義缺氧誘導因子-1α逆轉乳腺癌多藥耐藥的研究.pdf

1、研究背景：腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的產生是腫瘤化療中經常遇到的現象，也是導致其化療失敗，腫瘤復發(fā)、轉移的一個主要原因。原發(fā)性乳腺癌對化療比較敏感，大多數初治患者應用結構和機制不同的各類細胞毒性藥物獲得緩解，但往往緩解率高，緩解期短，并且絕大多數產生了MDR。MDR的發(fā)生機制復雜，其中mdrl基因及其表達產物P-糖蛋白的過表達是最主要的原因?，F已證實具有外排功能的P-gp在多種耐藥的細胞系中高表達。

2、現在關于P-gp在腫瘤細胞中高表達的機制并不十分清楚，因此MDR的產生機制和逆轉方法的研究成為腫瘤研究的重點。除mdrl基因過表達這一主要因素外，腫瘤細胞微環(huán)境的改變與腫瘤多藥耐藥的關系成為MDR機制和逆轉研究的新熱點。腫瘤細胞微環(huán)境改變中最重要的是細胞的缺血缺氧，由于缺氧誘導因子-1(Hypoxia inducible factor 1，HIF-1)在細胞缺氧改變中占有重要中心地位，因此HIF-l與腫瘤細胞多藥耐藥的關系備受關注。

3、 惡性腫瘤組織的一個顯著特點就是快速增殖性。在腫瘤生長過程中，由于腫瘤細胞增生迅速，造成腫瘤微環(huán)境始終處于相對缺氧狀態(tài)。實驗表明，幾乎所有的實體瘤中均有缺氧細胞存在，其數量與腫瘤的組織學類型及增長速度有關，通常其比例隨腫瘤體積增加而增加。缺氧可觸發(fā)腫瘤產生一系列應激性保護反應，使得腫瘤細胞在缺氧狀態(tài)下免受損傷或死亡。有研究表明腫瘤細胞中存在的缺氧誘導因子-1在腫瘤缺氧環(huán)境中起著中樞紐帶作用。HIF-1是一個由HIF-1α和HIF-1

4、β亞單位構成的異二聚體，其中HIF-1中亞單位HIF-1α對氧的依賴性較強，當周圍環(huán)境的氧濃度下降時，HIF-1α表達增加，并且其表達增加表現在多個水平上，包括轉錄和蛋白等水平，但主要是蛋白水平明顯增多。亞單位HIF-1β對氧的依賴性較弱，但在HIF-1中也必不可少，因為只有在兩個亞單位聚合并且發(fā)生適形性變化后，與其要調節(jié)的下游因子或酶的低氧反應性元件( hypoxicresponsive element，HRE)結合，才能發(fā)揮調節(jié)作用

5、。HIF-1α在人類多種腫瘤組織中高表達，甚至在癌前病變和某些增生性疾病中出現，同時有研究表明實體腫瘤和轉移灶中無血管區(qū)的腫瘤細胞由于缺氧導致對抗腫瘤藥物的抵抗。 傳統逆轉MDR的藥物由于逆轉劑量對人體的副作用極大而在臨床應用中受到限制，新型多藥耐藥產生機制和有效逆轉靶點的研究成為極具價值的攻克腫瘤和多藥耐藥的關鍵，因此尋找新的針對乳腺癌多藥耐藥的目的基因是亟待研究的課題。對HIF-lα與乳腺癌多藥耐藥關系的研究有助于發(fā)現耐藥產

6、生的新機制，并為治療乳腺癌和多藥耐藥的逆轉提供新的作用靶點和治療途徑。 研究目的：研究缺氧誘導因子—1α在腋淋巴結陰性乳腺癌組織中的表達及其與P-糖蛋白表達的相關性；檢測有氧和缺氧條件下缺氧誘導因子—1α在乳腺癌敏感細胞MCF-7和多藥耐藥細胞MCF-7/ADR中的表達情況及其與MDR的關系；利用HIF-1α基因片段構建其反義真核表達載體并通過脂質體介導轉染到體內外腫瘤細胞中，觀察對細胞的凋亡誘導效應、周期阻滯效應和耐藥逆轉作用

7、；在體內外腫瘤細胞中聯合過表達抑癌基因PTEN和反義HIF-1α，觀察PTEN對反義HIF-1α逆轉乳腺癌MDR的協同作用，為乳腺癌的靶向性基因治療和耐藥逆轉提供理論基礎和實驗依據。 研究方法： 1．采用免疫組織化學方法檢測81例腋淋巴結陰性乳腺癌(Axillary Node-Negative Breast Carcinoma，ANNBC)和相應癌旁組織中HIF-lα、P-gp的表達狀況，并對患者進行5年隨訪，分析兩者的

8、表達與各臨床病理因素和預后的關系。 2．乳腺癌MCF-7細胞和耐藥細胞MCF-7/ADR分別置于有氧和缺氧條件下培養(yǎng)，采用RT-PCR方法檢測中HIF-1α、mdrl mRNA變化，并探討兩者的時效關系；Western blotting觀察HIF-1α、P-gp蛋白水平的變化；MTT、Rhl23外排實驗觀察P-gp功能的變化；流式細胞術檢測細胞凋亡率和周期的改變。 3．利用HIF-1α基因片段構建其反義真核表達載體并初步

9、觀察其體內外逆轉乳腺癌多藥耐藥性的作用。 4．體內外聯合應用過表達抑癌基因PTEN和反義HIF-1α觀察PTEN對反義HIF-1α逆轉乳腺癌MDR的協同作用。 結果： 1．HIF-1α在乳腺癌中總陽性表達率為69.1％，其中強表達10例(12.3％)，中度表達12例(14.8％)，弱表達34例(42.0％)，陰性25例(30.9％)；81例乳腺癌組織中34例P—gp表達陽性，占42.0％，其中強表達7例

10、(8.64％)，中度表達9例(11.1％)，弱表達18例(22.2％)，陰性47例(58.0％)；HIF—lα和P—gp在乳腺癌中兩者陽性指數呈正相關(r=0.62，p<0.01)；HIF一1α陽性為單獨影響乳腺癌預后的危險因素。 2．缺氧lh時MCF一7細胞的HIF—lα mRNA已有表達，在缺氧3h時達到最高(5．4倍)；缺氧1h時MCF一7/ADR細胞的HIF一1α mRNA有表達，在缺氧3h時達到最高(5.9倍)。缺氧時M

11、CF一7細胞中開始出現mdrl mRNA的表達并在缺氧12h時達到最高(5.7倍)；缺氧條件下MCF一7/ADR細胞中mdrl mRNA的表達也增強(缺氧1h為1.4倍，缺氧12小時為2.3倍)。統計顯示，有氧和缺氧條件下細胞中HIF—lα、mdrl mRNA的表達均有顯著性差異(p<0.05)。相關分析顯示缺氧條件下MCF一7、MCF一7/ADR細胞中HIF一lα、mdrl基因的mRNA表達為正相關(r<,S>=1.258，p<0.0

12、l，r<,S>=0.416，p<0.05)。細胞缺氧12h時HIF一1α蛋白的表達最高，缺氧24h時表達不再升高。缺氧條件下MCF一7細胞中開始出現P—gp的表達，在24h表達最高并且不再增加；MCF一7/ADR細胞缺氧條件下P—gp表達也明顯增加。MTT法和Rhl23外排實驗表明缺氧條件下細胞的P—gp功能增強。流式細胞術結果顯示缺氧條件下細胞發(fā)生周期阻滯、凋亡率降低。 3。酶切電泳和測序結果顯示成功構建了針對HIF一lα的反

13、義真核表達載體。脂質體介導轉染兩種細胞后，實驗2組細胞中HIF一1α、mdr一1mRNA、蛋白顯著降低(p<0.05)；細胞TCL測定MCF一7細胞轉染前后細胞TCL改變無統計學意義(p>0.05)；MCF一7/ADR實驗2組TCL與對照組、實驗1組之間均有顯著性差異(P<0.05)；Rhl23外排實驗顯示實驗2組中的兩種細胞外排能力顯著增強；流式細胞術證實實驗2組較對照組凋亡率升高，S期細胞數目增加。動物移植瘤實驗證實asHIF一la

14、可抑制腫瘤生長，免疫組化、Western blotting顯示實驗2組移植瘤中HIF—la p—gp表達低于對照組和實驗1組。 4．聯合轉染抑癌基因PTEN和反義HIF—lα，與對照組相比實驗4組細胞中HIF一lα、mdr—lmRNA、蛋白顯著降低(p<0.01)，實驗4組細胞中HIF—lα、mdrl mRNA、蛋白較實驗2、3組也有顯著降低(p<0.05)；MTT、法檢測TCL結果顯示，MCF一7細胞轉染asHIF或PTEN后

15、細胞TCL改變與對照組比較無統計學意義(p>0.05)，但細胞TCL有減少的趨勢；實驗4組TCL改變與對照組比較有統計學意義(P<0.05)，與實驗2組、實驗3組比較也有統計學意義(p<0.05)。MCF-7/ADR實驗2組、實驗3組、實驗4組TCI與對照組之間均有顯著性差異(p<0.05)，實驗4組與實驗2組、實驗3組比較也有統計學意義(p<0.05)；羅丹明(Rhl23)外排實驗中實驗2組、實驗3組、實驗4組較對照組外排能力均增強(

16、p<0.05)，同時實驗4組與實驗2組、實驗3組比較外排能力均增強(p<0.05)。實驗2組、實驗3組、實驗4組比較對照組S期細胞比例增多，細胞凋亡率升高(p<0.05)，同時實驗4組與實驗2組、實驗3組比較S期細胞比例增多，細胞凋亡率也增強(p<0.05)。 結論：1．缺氧誘導因子1α可作為判斷ANNBC預后的單獨指標，檢測HIF-1α的表達有助于臨床上更準確地評估ANNBC生存率；在ANNBC中HIF-1α表達與P-gp之間

17、呈正相關，聯合檢測HIF-1α和P-gp的表達可以更好的判斷腫瘤對化療的敏感性，指導臨床治療。 2．在ANNBC中HIF-1α表達與P-gp之間呈正相關；缺氧培養(yǎng)條件下，MCF-7、MCF-7/ADR細胞中HIF-1α和P-gp在mRNA、蛋白水平上表達均升高，并且兩者的表達有時效相關性，提示HIF-1α與腫瘤MDR密切相關，HIF-1α可作為逆轉腫瘤MDR的-個新靶點。 3．體內外應用反義真核表達載體antis

18、enseHIF-1α/pcDNA3.0可以顯著降低缺氧細胞中HIF-1α的表達，進而可以部分逆轉缺氧條件下由P-gp介導的MDR。同時asHIF-1α/pcDNA3.0可以引起腫瘤細胞發(fā)生凋亡、減少周期阻滯等，在逆轉非P-gp介導的MDR中有-定作用。 4．體內外過表達抑癌基因PTEN可以抑制缺氧誘導因子-1α的生成，與反義缺氧誘導因子-1α聯合轉染可以更加顯著地降低缺氧細胞中HIF-1α的表達，所以能夠更大程度的逆轉缺氧條件下