肺腺癌中缺氧誘導(dǎo)因子-1α調(diào)控程序性死亡因子配體1的表達(dá).pdf

1、研究背景及目的：
　　非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，約占肺癌總數(shù)的85％[1]。肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的一種重要的病理類型，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。腫瘤細(xì)胞免疫逃逸是目前的研究熱點(diǎn)，程序性死亡因子1（programmed death-1，PD-1）及其配體程序性死亡因子配體1(programmed deathligand1，PD-L1)是參與腫瘤免疫逃

2、逸的重要分子，在多種腫瘤中高表達(dá)[3]。目前針對(duì)PD-1/PD-L1免疫檢查位點(diǎn)的單抗如nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab等已應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌臨床試驗(yàn)和治療，并取得了令人欣喜的臨床效果[4-6]，但仍存在一些急需解決的問題，如較多患者對(duì)藥物沒有反應(yīng)性、影響藥物療效的機(jī)制不明確等[7-8]。因此，研究腫瘤中PD-L1表達(dá)特征和相關(guān)調(diào)控機(jī)制及其在PD-1/PD-L1阻斷治療中的預(yù)測(cè)和預(yù)后價(jià)值具有重要臨

3、床意義[9]。缺氧是實(shí)體瘤微環(huán)境的重要生物學(xué)特征[10]，廣泛存在于大多數(shù)實(shí)體瘤中的缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由HIF-1α亞單位和HIF-1β亞單位組成，其中HIF-1α是氧調(diào)節(jié)單位，是調(diào)控腫瘤細(xì)胞多種基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)適應(yīng)缺氧環(huán)境的重要因子。近兩年來，有研究報(bào)道缺氧條件下HIF-1α可調(diào)控PD-L1的表達(dá)[11-14]。然而，肺腺癌中PD-L1的表達(dá)是否受缺

4、氧微環(huán)境及HIF-1α調(diào)控影響尚無報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過免疫組化法分析臨床肺腺癌組織標(biāo)本中HIF-1α、PD-L1表達(dá)相關(guān)性，并利用癌癥基因組圖譜計(jì)劃(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證組化結(jié)果，及分別用CoCl2模擬化學(xué)性缺氧和siRNA沉默HIF-1α處理人肺腺癌細(xì)胞系，探究肺腺癌中HIF-1α對(duì)PD-L1表達(dá)的調(diào)控作用和機(jī)制。
　　研究方法：
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)99例

5、肺腺癌組織中HIF-1α、PD-L1的表達(dá);利用TCGA數(shù)據(jù)庫分別分析230名肺腺癌患利者[15]和178名肺鱗癌患者[16]數(shù)據(jù)組中HIF-1α、PD-L1 mRNA表達(dá)相關(guān)性;CoCl2模擬化學(xué)性缺氧分別處理人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975和HCC827，實(shí)驗(yàn)分為Normal組、CoCl2組，qRT-PCR檢測(cè)HIF-1α、PD-L1 mRNA表達(dá)，Western blotting檢測(cè)HIF-1α、PD-L1蛋白表達(dá);siRNA-HI

6、F-1α分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975和HCC827，分為NC組、siR-HIF-1α組，qRT-PCR、Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及PD-L1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，肺腺癌組織中HIF-1α陽性表達(dá)呈棕褐色細(xì)顆粒，染色定位于細(xì)胞核。PD-L1陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒，染色定位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)。99例肺腺癌組織中，HIF-1α、PD-L1陽性率分別為4

7、7.48％(47/99)、34.34％(34/99)。2.99例肺腺癌組織中，HIF-1α表達(dá)水平與患者年齡和臨床分期有關(guān)(P＜0.05)，與性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。
　　3.99例肺腺癌組織中，PD-L1表達(dá)水平與患者臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。
　　4.Spearman相關(guān)分析法分析免疫組化結(jié)果顯示，肺腺癌中HIF-

8、1α蛋白表達(dá)和PD-L1蛋白表達(dá)正相關(guān)（r=0.292，P＜0.01）。進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫中230名肺腺癌患者組HIF-1α和PD-L1 mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與組化結(jié)果一致，肺腺癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表達(dá)正相關(guān)（r=0.467，P＜0.001）。此外，我們還分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中178名肺鱗癌患者組HIF-1α和PD-L1 mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)肺鱗癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表達(dá)無相關(guān)性（r=0.10

9、8，P＞0.05）。
　　5.CoCl2模擬化學(xué)性缺氧處理肺腺癌細(xì)胞NCI-H197524h后，與Normal組相比，CoCl2組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)水平隨之明顯升高(P＜0.01); CoCl2模擬化學(xué)性缺氧處理肺腺癌細(xì)胞HCC82724h后，與Normal組相比，CoCl2組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)水平隨之明顯升

10、高（P＜0.05）。
　　6.siRNA轉(zhuǎn)染沉默肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975 HIF-1α基因，48h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率確保HIF-1α基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步檢測(cè)PD-L1表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，siR-HIF-1α組與NC組相比，PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05); siRNA轉(zhuǎn)染沉默肺腺癌細(xì)胞HCC827 HIF-1α基因，48h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率確保HIF-1α基因表達(dá)下調(diào)，迸一步檢測(cè)PD-L1表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，siR-HI