程序性細胞死亡因子-1在慢性HBV感染中的作用.pdf

1、背景:乙型肝炎發(fā)病機制復雜，受病毒、宿主及二者相互作用的影響，病毒方面包括病毒蛋白、基因型等，而宿主方面的則主要包括宿主遺傳背景、免疫狀態(tài)因素等，宿主與病毒因素間平衡是影響疾病進展與轉歸的核心環(huán)節(jié)。核苷（酸）類似物(Nucleoside/Nucleotide analogues，NAs)是一類口服抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）藥物，主要作用機制是其進入細胞內首先成為三磷酸化合物，通過與底物的競爭，抑制病毒的

2、聚合酶或反轉錄酶，終止HBV DNA鏈的延長。近來研究表明，NAs可能還具有免疫調節(jié)作用。對服用NAs抗病毒治療的慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者的研究表明:NAs治療可以調節(jié)Th1/Th2平衡，改善Treg細胞增殖，促進機體免疫功能的增強或恢復。臨床中NAs抗HBV感染的療效具有個體差異性，其影響因素除病毒基因型外，宿主的遺傳背景也具有很大作用，而宿主的遺傳背景主要由單核苷酸多態(tài)性（Single

3、 nucleotide polymorphism，SNP）決定。SNP指由單個核苷酸A、T、C或G的改變而引起的DNA序列的改變，從而造成的不同物種間或人體內染色體基因組的多樣性。SNP構成人類基因組90％以上的變異，廣泛用于連鎖分析與基因定位、疾病易感性、群體遺傳學與進化生物學、藥物基因組、環(huán)境基因組學等研究。目前文獻報道的與HBV感染預后相關的SNP包括:人類白細胞抗原結構區(qū)的HLA DRBA*1302、MHC-Ⅰ、Ⅱ位點，非人類白

4、細胞抗原結構區(qū)的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、雌激素受體-α、甘露糖結合蛋白、維生素D受體、白介素-10、干擾素γ誘導的蛋白-10、程序性細胞死亡因子-1等基因。程序性細胞死亡因子-1（Programmed celll death-1，PD-1）屬于CD28家族和Ig超家族，是一種相對分子質量約50-55KDa的Ⅰ型跨膜蛋白，表達于活化的CD4+和CD8+T細胞、B細胞和骨髓細胞，在未活化的淋巴細胞不表達。慢性HBV感染時，肝細胞表面過

5、度表達PD-1的配體PD-L1，通過PD-1/PD-L1信號通路抑制CD8+T細胞的表達，T細胞耗竭導致IFN-γ、TNF-α等抗病毒細胞因子的表達減少，病毒持續(xù)存在。PD-1的不同等位基因的表達在HBV感染患者、肝硬化患者和健康人群中不同，且其內含子的SNP與外周血病毒載量相關。最近研究發(fā)現(xiàn)在HBV和HIV/HBV感染的CHB患者中，外周血Treg細胞的擴增與HBV DNA載量相關且表現(xiàn)為抑制HBV特異性免疫反應;阿德福韋酯治療可阻斷

6、PD-1受體表達，抑制HBV復制，減少Treg細胞數(shù)量和功能，顯著提高HBV特異性CD8+T效應細胞，從而增強免疫應答。目前關于PD-1在HBV慢性感染中的作用研究尚未十分明確，PD-1單核苷酸多態(tài)性與HBV感染自發(fā)清除和抗HBV療效的研究較少，且研究結果不一致，NAs抗病毒治療與PD-1及其相關因子是否存在關聯(lián)，是否能夠影響宿主的免疫功能尚存在爭議。
　　目的:本研究通過測定HBV感染自發(fā)清除者、CHB患者（包括NAs治療者和未

7、抗HBV者）及HBV相關慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronicliver failure，ACLF)患者血清及肝組織表達PD-1的水平，探討不同HBV感染階段PD-1的水平的變化，評價NAs對PD-1表達水平的影響，分析血清PD-1與慢性HBV感染者臨床生化指標及病毒載量的相關性，探討PD-1在HBV感染發(fā)展及轉歸中的作用。通過測定HBV感染自發(fā)清除者、CHB患者（包括NAs治療者和未抗HBV者）及HBV相關慢加急性肝衰竭(A

8、cute-on-chronic liver failure，ACLF)患者血清PD-1、IL-10、IFN-γ水平，HBV DNA載量，以及外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率，探討NAs對PD-1/PD-L1抑制通路的影響，及對宿主免疫功能的作用。通過分析不同HBV感染狀態(tài)人群及NAs治療不同應答患者的SNP，探索PD-1的SNP在HBV感染預后轉歸中的作用，及其與NAs抗HBV治療的關系，證實NAs在抗HBV治療中免疫調節(jié)的作用，研

9、究PD-1等位基因在抗HBV治療中的作用。
　　方法:
　　1、慢性HBV感染患者程序性細胞死亡因子-1水平變化與意義
　　篩選河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院感染科自2013年10月至2015年1月的病例:(1)慢性HBV感染病例:CHB病例符合2010年中華醫(yī)學會肝病學分會和感染病學分會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準，并且排除有其他肝炎病毒合并感染者。HBV-ACLF病例診斷符合我國2012年中華醫(yī)學會感染病學分會肝衰

10、竭與人工肝學組、中華醫(yī)學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組制定的《肝衰竭診療指南》，抗HBV治療者要求服用NAs單藥或聯(lián)合治療，未抗HBV治療者要求不曾使用任何NAs和/或干擾素抗病毒治療。(2)自發(fā)清除病例:抗-HBs、抗-HBe、抗HBc兩項或三項均陽性，HBV DNA陰性，肝功能正常，肝膽脾超聲檢查正常，未曾接受過任何抗病毒治療的既往HBV感染者。病例排除標準:(1)合并妊娠及HAV、HCV、HDV、HEV、HIV、EBV、CMV等

11、其他病毒感染者;
　　(2) NAs與干擾素或中藥合用者;(3)患者伴有惡性腫瘤、嚴重免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病或明顯精神病史。收集臨床資料包括:性別、年齡、診斷、治療、用藥時間。NAs治療病例均定期檢查肝功能(ALT、ALB、TB)、HBV病毒標記物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)、HBV DNA載量。使用全自動生化分析儀檢測所有入組患者ALB、ALT、TB等血清生化指標;全自動血凝儀檢測PTA、I

12、NR;實時熒光定量PCR檢測HBV DNA載量（檢測下限為500copies/ml）;抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清PD-1含量;Westemblot檢測肝組織中PD-1蛋白的表達水平。統(tǒng)計學分析采用IBMSPSS Statistics19統(tǒng)計軟件，計量資料以(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)分析前進行正態(tài)性及方差齊性檢驗。若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布且方差齊同(P＞0.0

13、5)則應用t檢驗進行比較，若方差不齊(P＜0.05)則應用t'檢驗進行比較，多組之間比較應用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗;若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊時，采用KruskalWallis H秩和檢驗。計數(shù)資料采用x2檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析。按α=0.05水準，雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　2、HBV介導的PD-1/PD-L1抑制通路在慢性乙型病毒性肝炎疾病進展中的作用
　　篩選河

14、北醫(yī)科大學第三醫(yī)院感染科自2013年10月至2015年1月的病例:(1)慢性HBV感染病例:CHB病例符合2010年中華醫(yī)學會肝病學分會和感染病學分會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準，并且排除有其他肝炎病毒合并感染者。HBV-ACLF病例診斷符合我國2012年中華醫(yī)學會感染病學分會肝衰竭與人工肝學組、中華醫(yī)學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組制定的《肝衰竭診療指南》，抗HBV治療為服用NAs單藥或聯(lián)合治療。(2)自發(fā)清除病例:抗-H

15、Bs、抗-HBe、抗HBc兩項或三項均陽性，HBV DNA陰性，肝功能正常，肝膽脾超聲檢查正常，未曾接受過任何抗病毒治療的既往HBV感染者。病例排除標準:(1)合并妊娠及HAV、HCV、HDV、HEV、HIV、EBV、CMV等其他病毒感染者;(2) NAs與干擾素或中藥合用者;(3)患者伴有惡性腫瘤、嚴重免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病或明顯精神病史。收集臨床資料包括:性別、年齡、診斷、治療、用藥時間。NAs治療病例均定期檢查肝功能(ALT、

16、ALB、TB)、HBV病毒標記物（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）、HBV DNA載量。使用全自動生化分析儀檢測所有入組患者ALB、ALT、TB等血清生化指標;實時熒光定量PCR檢測HBV DNA載量（檢測下限為500copies/ml）;ELISA檢測血清PD-1、IL-10、IFN-γ含量;取清晨空腹外周靜脈血3ml應用流式細胞儀檢測外周血HBV特異性CD8+T細胞。統(tǒng)計學分析采用IBM SPSS Sta

17、tistics19統(tǒng)計軟件，計量資料以(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)分析前進行正態(tài)性及方差齊性檢驗。若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布且方差齊同（P＞0.05）則應用t檢驗進行比較，若方差不齊(P＜0.05)則應用t'檢驗進行比較，多組之間比較應用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗;若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊時，采用Kruskal WallisH秩和檢驗。計數(shù)資料采用x2檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析。按α=0.05水準，雙側P＜0

18、.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　3、程序性細胞死亡因子-1單核苷酸多態(tài)性與抗HBV感染療效的相關性分析
　　篩選河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院感染科自2013年10月至2014年8月HBV感染病例195例。病例納入標準:(1) HBV感染病例:CHB病例符合2010年中華醫(yī)學會肝病學分會和感染病學分會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準，并且排除有其他肝炎病毒合并感染者。HBV-ACLF病例診斷符合我國2012年中華醫(yī)學會感染病學分

19、會肝衰竭與人工肝學組、中華醫(yī)學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組制定的《肝衰竭診療指南》，抗HBV治療為服用NAs單藥或聯(lián)合治療。(2)自發(fā)清除病例:抗-HBs、抗-HBe、抗HBc兩項或三項均陽性，HBV DNA陰性，肝功能正常，肝膽脾超聲檢查正常，未曾接受過任何抗病毒治療的既往HBV感染者。病例排除標準:(1)合并妊娠及HAV、HCV、HDV、HEV、HIV、EBV、CMV等其他病毒感染者;(2) NAs與干擾素或中藥合用者;(3)患

20、者伴有惡性腫瘤、嚴重免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病或明顯精神病史。療效判定:NAs治療12周時血清HBV DNA應用PCR法檢測不到或低于檢測下限(500copies/ml)，或較基線下降≥2log10為早期應答者;12周時HBV DNA載量較基線下降＜2log10為非早期應答者。NAs治療4周時血清HBV DNA應用PCR法檢測不到或低于檢測下限(500copies/ml)，或較基線下降≥2log10為快速應答者;4周時HBV DNA載量

21、較基線下降＜2log10為非快速應答者。取清晨空腹外周靜脈血3ml，應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析法，測定rs10204525、rs2227982、rs7421861和rs6710479的基因型，分析這四個位點等位基因分布頻率與HBV感染自發(fā)清除和NAs抗HBV療效的關系。采用IBMSPSS Statistics19軟件進行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用卡方檢驗，當出現(xiàn)P≈a或n＜40時，用Fisher精確概率法進行計算，全部檢驗

22、均為雙側檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應用SHEsis軟件進行Hardy-Weinberg平衡分析，對照組P＞0.05為符合遺傳平衡定律。
　　結果:
　　1慢性HBV感染患者程序性細胞死亡因子-1水平變化與意義
　　1.1納入病例的人口學特點與臨床資料。本研究共納入86例病例。CHB組46例（未抗病毒治療組23例，NAs抗病毒治療組23例），ACLF組20例，HBV自發(fā)清除組20例。各組病例性別和年齡比較差異

23、無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CHB未抗病毒治療組病例HBV DNA載量、ALT水平顯著高于NAs抗病毒治療組病例(P＜0.05)，兩組間TB、ALB水平比較無差異(P＞0.05)。HBV自發(fā)清除組ALB水平顯著高于CHB組和ACLF組(P＜0.05)，ALT、TB水平均顯著低于CHB組和ACLF組(P＜0.05)。CHB組ALB水平顯著高于ACLF組(P＜0.05)，HBV DNA載量、ALT、TB水平均顯著低于ACLF組(P＜0.0

24、5)。
　　1.2 CHB未抗病毒治療組、CHB NAs抗病毒治療組、ACLF組和HBV自發(fā)清除組間血清PD-1水平比較。ACLF組血清PD-1水平（17.542±2.265ng/ml）顯著高于CHB未抗病毒治療組（15.533±2.194 ng/ml）、CHB NAs抗病毒治療組（12.849±2.193 ng/ml）及HBV自發(fā)清除組（10.641±4.192ng/ml），差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。CHB未抗病毒

25、治療組血清PD-1水平顯著高于CHB NAs抗病毒治療組及HBV自發(fā)清除組，CHBNAs抗病毒治療組血清PD-1水平顯著高于HBV自發(fā)清除組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　1.3 CHB未抗病毒治療組、CHB NAs抗病毒治療組、ACLF組和HBV自發(fā)清除組間肝組織PD-1蛋白表達比較。共40例病例接受肝臟PD-1蛋白表達檢測，CHB未抗病毒治療組10例，CHB NAs抗病毒治療組10例，ACLF組10例和HBV自發(fā)

26、清除10例。Westemblot檢測示:ACLF組PD-1蛋白表達水平（1.274±0.362）顯著高于CHB未抗病毒治療組(1.074±0.088)、CHB NAs抗病毒治療組（0.813±0.156）及HBV自發(fā)清除組(0.593±0.116)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。CHB未抗病毒治療組PD-1蛋白表達水平顯著高于CHB NAs抗病毒治療組及HBV自發(fā)清除組，CHB NAs抗病毒治療組PD-1蛋白水平顯著高于HBV

27、自發(fā)清除組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　1.4血清PD-1水平與HBV DNA載量、ALT、TB及ALB相關性分析。CHB組和ACLF組病例血清PD-1水平與HBV DNA載量均成正相關(r=0.568，P＜0.001;r=0.729，P＜0.001)。CHB組病例血清PD-1水平與ALT水平成正相關（r=0.373，P=0.011），與ALB水平呈負相關(r=-0.457，P=0.001)，與TB水平無明顯相關(

28、P＞0.05)。ACLF組病例血清PD-1水平與ALB水平呈負相關(r=-0.756，P＜0.001)，與ALT和TB水平無明顯相關(P＞0.05)。
　　2 HBV介導的PD-1/PD-L1抑制通路在慢性乙型病毒性肝炎疾病進展中的作用
　　2.1納入病例的人口學特點與臨床資料。本研究共納入86例病例。CHB組46例（未抗病毒治療組23例，NAs抗病毒治療組23例），ACLF組20例，HBV自發(fā)清除組20例。各組病例性別和年

29、齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HBV自發(fā)清除組ALB水平顯著高于CHB組和ACLF組(P＜0.05)，ALT、TB水平均顯著低于CHB組和ACLF組(P＜0.05)。CHB組ALB水平顯著高于ACLF組(P＜0.05)，HBV DNA載量、ALT、TB水平均顯著低于ACLF組(P＜0.05)。CHB未抗病毒治療組病例HBVDNA載量、ALT水平顯著高于NAs抗病毒治療組病例(P＜0.05)，兩組間TB、ALB水平比較無差異(P

30、＞0.05)。
　　2.2血清學指標分析
　　2.2.1血清PD-1水平比較。結果同第一部分。
　　2.2.2血清IL-10水平比較。ACLF組血清IL-10水平（62.43±21.93 pg/ml）顯著高于CHB未抗病毒治療組（41.59±16.46 pg/ml）、CHB NAs抗病毒治療組（25.10±11.94 pg/ml）及HBV自發(fā)清除組(20.83±9.71 pg/ml)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.00

31、1)。CHB未抗病毒治療組血清IL-10水平顯著高于CHB NAs抗病毒治療組及HBV自發(fā)清除組(P＜0.01)，CHB NAs抗病毒治療組血清IL-10水平與HBV自發(fā)清除組比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.2.3血清IFN-γ水平比較。ACLF組血清IFN-γ水平（79.08±31.79 pg/ml）顯著高于CHB未抗病毒治療組（32.66±20.47 pg/ml）、CHB NAs抗病毒治療組（51.95±25.58

32、pg/ml）及HBV自發(fā)清除組（58.63±17.7 pg/ml），差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。CHB未抗病毒治療組血清IFN-γ水平顯著低于CHB NAs抗病毒治療組及HBV自發(fā)清除組(P＜0.01)，CHB NAs抗病毒治療組血清IFN-γ水平與HBV自發(fā)清除組比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.3外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率比較。ACLF組外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率（0.85±0.39％）

33、顯著高于CHB未抗病毒治療組(0.21±0.25％)、CHB NAs抗病毒治療組（0.41±0.47％）及HBV自發(fā)清除組（0.00±0.00％），差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。CHB NAs抗病毒治療組外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率顯著高于CHB未抗病毒治療組及HBV自發(fā)清除組(P＜0.05)，CHB NAs未抗病毒治療組外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率明顯高于HBV自發(fā)清除組(P＜0.05)。
　　2.4相

34、關性分析
　　2.4.1 HBV DNA載量與血清PD-1、IL-10、IFN-γ水平相關性分析。CHB組和ACLF組HBV DNA載量與血清PD-1水平均成正相關(r=0.568，P＜0.001;r=0.729，P＜0.001)，與血清IL-10水平均成正相關(r=0.541，P＜0.001;r=0.560，P=0.01)，與血清IFN-γ水平均成負相關(r=-0.319，P＜0.05;r=-0.832,P＜0.001)。

35、>　　2.4.2外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率與血清PD-1水平和HBV DNA載量相關性分析。CHB組外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率與血清PD-1水平成正相關（r=0.438，P=0.002），與HBV DNA載量不相關(r=0.072，P=0.634)。ACLF組外周血HBV特異性CD8+T細胞頻率與血清PD-1水平和HBV DNA載量均成正相關(r=0.838，P＜0.001;r=0.595，P=0.006)。

36、　　3程序性細胞死亡因子-1單核苷酸多態(tài)性與抗HBV感染療效的相關性分析
　　3.1納入病例的人口學特點與臨床資料。共納入195例病例，CHB組90例（早期應答者65例，非早期應答者25例），ACLF組45例（快速應答者30例，非快速應答者15例），HBV自發(fā)清除組60例。CHB組、ACLF組和自發(fā)清除組間病例年齡、性別均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。CHB組中的早期應答者和非早期應答者間，ACLF組中的快速應答者和非快速應答者間

37、，年齡、性別，NAs治療前的HBV DNA載量、ALT、TB、ALB水平均無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.2等位基因分布頻率與抗HBV感染的關系。
　　3.2.1 rs10204525基因型等位基因A的出現(xiàn)頻率CHB組(76.7％)、ACLF組(67.8％)和HBV自發(fā)清除組(75.8％)間差異無統(tǒng)計學意義(x2=2.684，P=0.261);組間比較顯示等位基因A的出現(xiàn)頻率在HBV自發(fā)清除組(75.8％)與慢性HBV

38、感染組（CHB組+ACLF組）(73.7％)間(x2=0.955，P=0.328)，CHB組和ACLF組間（x2=2.446，P=0.118）均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。CHB組早期應答者等位基因A的出現(xiàn)頻率(80.8％)高于非早期應答者(66.0％)，差異具有統(tǒng)計學意義(x2=4.403，P=0.036);ACLF組快速應答者等位基因A的出現(xiàn)頻率(75.0％)高于非快速應答者(53.3％)，差異具有統(tǒng)計學意義（x2=4.299，P

39、=0.038）。
　　3.2.2 rs6710479基因型等位基因A的出現(xiàn)頻率HBV自發(fā)清除組(59.2％)低于CHB組(73.3％)和ACLF組(68.9％)，三組間差異具有統(tǒng)計學意義(x2=54.052，P＜0.001);組間比較顯示HBV自發(fā)清除組(59.2％)等位基因A的出現(xiàn)頻率低于慢性HBV感染組（CHB組+ACLF組）(71.9％)，差異具有統(tǒng)計學意義(x2=6.138，P=0.013)，CHB組和ACLF組間等位基因

40、分布差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.586，P=0.444)。CHB組早期應答者和非早期應答者間(x2=3.084，P=0.079)，ACLF組快速應答者和非快速應答者間（x2=1.435,P=0.231）等位基因A的出現(xiàn)頻率均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.2.3 rs2227982和rs7421861基因型等位基因分布頻率在HBV自發(fā)清除組、CHB組、ACLF組間，HBV自發(fā)清除組和慢性HBV感染組(CHB組+ACLF組)

41、間，CHB組和ACLF組間，CHB組早期應答者和非早期應答者間，及ACLF組快速應答者和非快速應答者間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）
　　3.3遺傳平衡檢驗。應用SHEsis軟件進行Hardy-Weinberg平衡分析，rs10204525 CHB組早期應答者(P＜0.001)和非早期應答者(P=0.922)符合遺傳平衡定律，ACLF組快速應答者(P=0.039)和非快速應答者(P=0.447)符合遺傳平衡定律;rs671

42、0479慢性HBV感染組(P=0.011)和HBV自發(fā)清除組（P=0.286）符合遺傳平衡定律。
　　結論:
　　1 PD-1的表達與HBV感染者疾病進展相關聯(lián)。
　　2 NAs抗HBV治療通過抑制HBV復制，促進HBV特異性CD8+T細胞產生，降低PD-1/PD-L1信號通路中PD-1的表達，調節(jié)Th1/Th2平衡，改善宿主的免疫功能。
　　3 PD-1rs6710479基因等位基因A不利于病毒自發(fā)清除，易導致