靶向程序性死亡因子配體1的新型免疫細(xì)胞因子的制備及抗腫瘤功能研究.pdf

1、目的:
　　靶向PD-L1的單抗具有免疫激活功能，并已顯示出對(duì)多種腫瘤的良好治療效果。其主要作用原理是通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞表面PD-L1分子與T細(xì)胞表面PD-1分子的結(jié)合，從而解除其對(duì)T細(xì)胞的抑制作用，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。但由于臨床上某些腫瘤細(xì)胞表面PD-L1低表達(dá)，應(yīng)用抗PD-L1單抗治療的療效較差，病情易反復(fù)。因此需要開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤免疫制劑來(lái)提高單抗療效，改善腫瘤愈后。IL-2因能激活體內(nèi)多種免疫細(xì)胞而可以用來(lái)治療腫瘤和炎癥性疾病

2、。但由于其受體廣泛表達(dá)，系統(tǒng)性應(yīng)用IL-2會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，我們采用基因工程技術(shù)，將靶向PD-L1抗體的Fc段與IL-2分子融合，構(gòu)建新型重組免疫細(xì)胞因子。其目的是使之能特異性靶向腫瘤區(qū)域，避免非特異性結(jié)合導(dǎo)致的的血管毒性;同時(shí)阻斷PD-1/PD-L1結(jié)合，使機(jī)體的適應(yīng)性免疫協(xié)同特異性免疫，激活T細(xì)胞，B細(xì)胞等多種淋巴細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，以期達(dá)到對(duì)抗原表達(dá)量低，單用抗體效果不明顯腫瘤的更好治療效果。
　　方法:
　

3、　首先，利用全基因合成技術(shù)將抗PD-L1單抗的IgG1亞類(lèi)抗體的Fc重鏈基因通過(guò)linker與突變后的IL-2基因融合，連接至表達(dá)載體pc3.1DNA，構(gòu)建重鏈質(zhì)粒。MPDL3280單抗的可變區(qū)基因連接至表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建輕鏈質(zhì)粒，并與重鏈質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過(guò)細(xì)胞批次培養(yǎng)，純化上清得到新型重組免疫細(xì)胞因子，簡(jiǎn)稱(chēng)BIPI。利用以下手段對(duì)其進(jìn)行表征鑒定:SDS-PAGE分析其分子量;FCM測(cè)定BIPI的親和力和抗

4、原結(jié)合力;體外檢測(cè)其對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞系CTLL-2細(xì)胞的促增殖作用;在小鼠的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌預(yù)防性腫瘤模型中評(píng)估其抑瘤活性，并在治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)小鼠體重，評(píng)估BIPI的安全性;利用抗體消除小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞，驗(yàn)證其在抑瘤過(guò)程中的作用;最后分離各治療組小鼠脾細(xì)胞，用磁珠法從混合細(xì)胞中分離得到CD8+T細(xì)胞，測(cè)定并比較各組間CD8+T細(xì)胞數(shù)量上的差異和其IFN-γ分泌量的不同，驗(yàn)證BIPI對(duì)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的激活作用并分析免疫細(xì)胞因子的作

5、用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　我們獲得了新型免疫細(xì)胞因子，經(jīng)分析其純度大于99％。經(jīng)SDS-PAGE、FCM等試驗(yàn)證實(shí)BIPI結(jié)構(gòu)正確并且與抗原有較好的結(jié)合活性。體外實(shí)驗(yàn)中，含有與IL-2同等摩爾質(zhì)量的BIPI與IL-2標(biāo)準(zhǔn)品有幾乎相同的促進(jìn)CTLL-2細(xì)胞生長(zhǎng)的效能。在弱表達(dá)PD-L1的CT26轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌小鼠模型上，與對(duì)照組相比顯著減少了肺表面腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量，證實(shí)了免疫細(xì)胞因子BIPI的抑瘤活性。在后續(xù)對(duì)其抑瘤機(jī)制研究的過(guò)

6、程中發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞在BIPI的抑瘤效果發(fā)揮上有重要作用;消除CD8+T細(xì)胞后，小鼠的生存期顯著縮短，并且生存狀態(tài)不佳。在治療結(jié)束后，將CD8+T細(xì)胞分離后培養(yǎng)，檢測(cè)其IFN-γ分泌量，結(jié)果顯示BIPI治療組顯著高于其他對(duì)照組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在體重監(jiān)測(cè)過(guò)程中各組小鼠體重均未發(fā)生異常改變，說(shuō)明治療性藥物并未對(duì)小鼠產(chǎn)生明顯毒性，提示其安全性良好。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們所構(gòu)建的新型重組免疫細(xì)胞因子BIPI具