吸煙與程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)及原發(fā)性肝癌相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景與目的：原發(fā)性肝癌是世界上流行最高的十種惡性腫瘤之一，流行病學(xué)資料已證實(shí)肝癌的發(fā)生是多因素協(xié)同作用的結(jié)果。在我國肝癌的發(fā)生主要與HBV、HCV感染、黃曲霉毒素（AFB1）攝入以及飲水污染等有關(guān)，而且具有較明顯的家庭易感性。其中環(huán)境因素較遺傳因素更為重要。日本還發(fā)現(xiàn)飲酒和吸煙均為HCC的危險(xiǎn)因素，且二者可協(xié)同作用。意大利的HCC病例中，大量飲酒占45％，HCV占30％，HBV占22％。每年約發(fā)病62萬例，其中42.5％發(fā)生在中國，

2、并有上升趨勢(shì)。而在這些患者疾病的進(jìn)程當(dāng)中，通常都有氧化應(yīng)激的持續(xù)存在。 程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）最早是作為在細(xì)胞凋亡早期上調(diào)的基因之一被發(fā)現(xiàn)的，近期的許多研究顯示它還是腫瘤的抑制基因。PDCD4被發(fā)現(xiàn)在能抵抗惡性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的JB6 P-細(xì)胞中高表達(dá)，而在對(duì)于惡性轉(zhuǎn)化敏感的P+細(xì)胞中則恰恰相反，并且，通過轉(zhuǎn)染反義的PDCD4序列使PDCD4表達(dá)降低，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)于腫瘤誘導(dǎo)物敏感而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，這一現(xiàn)象已經(jīng)在體內(nèi)試驗(yàn)中被證

3、實(shí)。盡管目前已經(jīng)有許多作用于轉(zhuǎn)錄階段的腫瘤抑制物被發(fā)現(xiàn)，PDCD4是目前為止第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)作用于蛋白翻譯階段的腫瘤抑制物。它通過與真核細(xì)胞翻譯起始因子eIF4A，eIF4G相作用，以一種mRNA特異性的方式來抑制翻譯，并影響了腫瘤發(fā)生階段的一些重要事件，比如AP-1依賴性的轉(zhuǎn)錄的激活非貼壁依賴性的生長和侵襲性的增加。腫瘤抑制物的失活對(duì)于腫瘤的發(fā)生具有很大作用，盡管許多腫瘤抑制物，例如p53，都是通過突變的方式來失活的，其他的一些比如PDC

4、D4卻不是通過這種方式來失活的。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，在一系列的腫瘤中，例如肺癌，結(jié)腸癌中，PDCD4的表達(dá)隨著腫瘤的進(jìn)展而下調(diào)，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)Akt，p70s6k可以在腫瘤誘導(dǎo)物TPA作用下和血清剝奪的情況下被激活，接著使PDCD4發(fā)生磷酸化而降解，并且ERK通路在TPA誘導(dǎo)的PDCD4下調(diào)這一過程當(dāng)中起著關(guān)鍵的作用。 吸煙（cigarette smoking，CS）是某些腫瘤進(jìn)展的危險(xiǎn)因素這一觀點(diǎn)現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛接受了，但是它導(dǎo)致癌

5、癥的具體機(jī)制仍無明確定論，特別是香煙組分當(dāng)中的水溶性部分的作用。過去有研究發(fā)現(xiàn)香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）可以在其作用的細(xì)胞中引起特異性的應(yīng)激反應(yīng)，比如產(chǎn)生氧化應(yīng)激，DNA條帶的斷裂，應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)等等。除此之外，吸煙也可以產(chǎn)生炎癥激活作用，例如它可以促進(jìn)白介素IL-8從支氣管上皮細(xì)胞釋放等。就我們所知，目前關(guān)于吸煙的危害主要集中在吸煙對(duì)肺癌的誘發(fā)作用及對(duì)肺部疾病和心血管疾病的作用的研究，雖然

6、曾有普查性的研究顯示吸煙會(huì)使肝癌的發(fā)病率增高，但目前很少有關(guān)于吸煙對(duì)于肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制的研究。在這里我們是想通過這項(xiàng)試驗(yàn)來觀察吸煙對(duì)于肝細(xì)胞中PDCD4基因的表達(dá)是否有影響，以及探索可能的影響機(jī)制。 方法： 1.臨床病例分析：觀察原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者中吸煙以及PDCD4表達(dá)情況的關(guān)系。由于影響肝細(xì)胞肝癌發(fā)病的因素很復(fù)雜，為了去除比較極端的因素，本研究制定了入選標(biāo)準(zhǔn)：1）男性；2）年齡>30歲：3）HBsAg陽性；4）術(shù)

7、前通過影像學(xué)檢查除外肺轉(zhuǎn)移及其他肝外轉(zhuǎn)移；5）經(jīng)歷肝細(xì)胞肝癌手術(shù)切除治療，術(shù)中確定剩余肝臟無腫瘤殘余；6）術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌，且標(biāo)本切緣無腫瘤殘余。嚴(yán)格準(zhǔn)入條件以盡量減少可能的干擾因素。收集患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本及癌旁無腫瘤細(xì)胞的正常組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法和western blotting法檢測(cè)腫瘤組織中及癌旁正常組織中PDCD4的表達(dá)情況。通過問診確定患者吸煙情況，明確患者每天吸煙平均支數(shù)，以及吸煙總年數(shù)，換算成每年吸

8、煙的包數(shù)（按照每包20支煙計(jì)算），同時(shí)綜合考慮患者病情確診時(shí)的年齡，手術(shù)中發(fā)現(xiàn)的腫瘤的大小，數(shù)目，門靜脈及肝靜脈侵襲情況，肝內(nèi)膽管侵襲情況，肝臟總體情況，以及腫瘤組織的分化情況。組織在數(shù)據(jù)搜集后被編碼，然后通過SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行曼-惠特尼U檢驗(yàn)和菲希爾精確度檢驗(yàn)，并以P<0.05確認(rèn)存在顯著性差異。 2.培養(yǎng)正常人類肝細(xì)胞L02，肝癌細(xì)胞HepG2，應(yīng)用針對(duì)人PDCD4的特異性抗體，通過western blot

9、法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)在這二種細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)情況的區(qū)別。根據(jù)以往研究提供的方法制備香煙提取物，簡(jiǎn)單來說，就是將兩支不帶過濾裝置的香煙連接一個(gè)改良過的注射器，使燃燒產(chǎn)生的煙霧通過50ml不含血清的DMEM培養(yǎng)液，通過測(cè)定pH值來確定終止點(diǎn)，在pH值達(dá)到7.4的時(shí)候終止。然后通過孔徑0.20μm濾膜除去細(xì)菌和雜質(zhì)。應(yīng)用5％濃度的CSE作用于人肝細(xì)胞L02不同時(shí)間，四氮唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞活性增殖性改變情況，RT-PCR檢測(cè)PDC

10、D4基因改變情況。然后分別應(yīng)用不同濃度（1％，5％，10％）的CSE作用于L02細(xì)胞4個(gè)小時(shí)，并應(yīng)用5％ CSE分別刺激L02細(xì)胞不同時(shí)間（1h，4h，16h，24h），通過western blot法檢測(cè)觀察PDCD4蛋白水平改變情況。通過使用新蛋白翻譯抑制劑放線菌酮，結(jié)合應(yīng)用5％ CSE刺激L02細(xì)胞4小時(shí)，觀察CSE對(duì)PDCD4蛋白的作用是發(fā)生在翻譯階段還是翻譯后階段。分別應(yīng)用相關(guān)通路特異性阻斷劑：PKC阻斷劑Ro31-8425，M

11、EK-ERK阻斷劑PD98059，PI3K阻斷劑LY294002，p38MAPK阻斷劑SB203580，JNK阻斷劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞，然后應(yīng)用5％ CSE刺激L02細(xì)胞4小時(shí)，收集細(xì)胞提取蛋白通過western blot測(cè)定PDCD4蛋白含量改變情況，以觀察上述通路在CSE對(duì)PDCD4作用過程中起的作用。 結(jié)果： 1.臨床病例分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分析的68名男性并且不伴轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者中，吸煙組和不吸煙組

12、的腫瘤組織中PDCD4表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。但是在癌旁正常組織的比較中，吸煙組PDCD4的表達(dá)明顯低于不吸煙組（P<0.05）分別對(duì)吸煙組和不吸煙組的腫瘤組織和癌旁組織中PDCD4含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在這兩組中，腫瘤組織中PDCD4的含量較之癌旁正常組織中的均有所降低，不吸煙組的腫瘤組織和癌旁組織中PDCD4的差別更加顯著（P<0.01）對(duì)于其他相關(guān)因素比較，我們發(fā)現(xiàn)吸煙組的平均發(fā)病年齡比不吸煙組低，而不吸煙組患者的肝臟一般情況

13、較差，二組在肝內(nèi)門靜脈，肝靜脈及肝內(nèi)膽管的侵及程度上沒有顯著性差異。 2.通過對(duì)正常肝細(xì)胞L02及肝癌細(xì)胞HepG2中PDCD4含量的比較，我們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中PDCD4蛋白含量較正常肝細(xì)胞減少，這一區(qū)別具有顯著性差異（P<0.05）。應(yīng)用5％濃度的CSE作用于人肝細(xì)胞L02不同時(shí)間，MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活性并無明顯影響，RT-PCR結(jié)果顯示PDCD4的mRNA的表達(dá)在CSE刺激下并無明顯改變。通過不同濃度CSE的刺激和同一濃

14、度不同時(shí)間的刺激，我們發(fā)現(xiàn)CSE刺激可以減少PDCD4蛋白水平，并且這一作用呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間依賴性。通過結(jié)合應(yīng)用新蛋白翻譯抑制劑放線菌酮和5％濃度的CSE，我們發(fā)現(xiàn)同時(shí)應(yīng)用這兩者的情況下PDCD4蛋白水平隨時(shí)間變化減少的更加迅速（P<0.05），這說明CSE對(duì)PDCD4的作用可能是發(fā)生在翻譯后。通過應(yīng)用特異性通路阻斷劑：PKC阻斷劑Ro31-8425，MEK-ERK阻斷劑PD98059，PI3K阻斷劑LY294002，p38 MAP

15、K阻斷劑SB203580，JNK阻斷劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞，然后應(yīng)用5％ CSE刺激L02細(xì)胞4小時(shí)，通過western blot檢測(cè)PDCD4表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)Ro31-8425，PD98059，LY294002均可明顯改變CSE減少PDCD4含量的作用，而SB203580，SP600125沒有明顯作用。 結(jié)論： 1.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中存在PDCD4含量減少的情況。吸煙與不吸煙者腫瘤組織中PDCD4含量沒有明顯差

16、異，提示PDCD4作為腫瘤抑制物減少到一個(gè)臨界點(diǎn)后發(fā)生了肝癌，之后可能由于某種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制不再繼續(xù)減少；吸煙者癌旁組織中PDCD4減少更加明顯，提示吸煙肝癌患者預(yù)后較之不吸煙者可能更差。 2.肝癌細(xì)胞HepG2中PDCD4的含量較之正常肝細(xì)胞L02有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.香煙燃燒提取物CSE可以導(dǎo)致正常肝細(xì)胞L02中PDCD4含量減少，但CSE并沒有明顯影響PDCD4的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，提示CSE減少PDCD4