β-arrestin2通過調(diào)控多藥耐藥基因1(MDR1)的表達(dá)影響乳腺癌多藥耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：乳腺癌嚴(yán)重威脅著女性的身體健康，化療是其非常有效的治療手段。然而，在乳腺癌臨床化療過程中，逐漸出現(xiàn)的多藥耐藥嚴(yán)重阻礙了化療的成功。多藥耐藥，即腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)抗藥性的同時，對其他結(jié)構(gòu)、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生抗藥性。多藥耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，人類多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的p-糖蛋白(MDR1/p-gp)的過表達(dá)是其最主要的機(jī)制之一。P-gp是一種鑲嵌于細(xì)胞膜上的泵蛋白，該蛋白過度表達(dá)可以導(dǎo)致化療藥物從腫瘤細(xì)胞

2、中外排增強(qiáng)，降低了細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對于化療藥物表現(xiàn)出抵抗性?，F(xiàn)如今，盡管已開發(fā)了多種針對MDR1/P-gp的抑制劑及調(diào)節(jié)劑，但其毒性及副作用限制了其臨床應(yīng)用，并未取得非常滿意的治療效果。近年來，基于調(diào)控P-糖蛋白轉(zhuǎn)錄的信號通路的分子靶向治療，或許可以為逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥帶來新的希望。β-抑制蛋白，包括β-arrestin1和β-arrestin2，是一種廣泛分布在各種組織和細(xì)胞的多功能蛋白，其經(jīng)典的功能是介導(dǎo)G蛋白耦聯(lián)

3、受體(GPCR)的脫敏和內(nèi)吞。此外，β-arrestin還可以結(jié)合其他信號分子，調(diào)節(jié)這些分子的磷酸化、泛素化或者細(xì)胞內(nèi)定位等，從而調(diào)控相應(yīng)的信號通路。最近很多的研究表明β-arrestin2在很多病理過程中發(fā)揮重要作用，尤其是廣泛參與很多惡性腫瘤的演進(jìn)過程。MistreAlemayehu等研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin2直接調(diào)節(jié)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中LPA誘導(dǎo)的侵襲和遷移過程。Buchanan等也發(fā)現(xiàn)β-arrestin2可以調(diào)

4、節(jié)大鼠結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程。此外，在乳腺癌中，β-arrestin2也可以通過caspase-8通路發(fā)揮抗凋亡作用。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，β-arrestin2還可能參與調(diào)節(jié)乳腺癌中MDR1/p-gp介導(dǎo)的多藥耐藥。我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌臨床標(biāo)本中β-arrestin2與MDR1/p-gp的表達(dá)密切相關(guān)。同時，我們檢測了β-arrestin2在乳腺癌敏感細(xì)胞系A(chǔ)DM以及耐藥細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在耐藥細(xì)胞中的蛋白和m

5、RNA水平均高于敏感細(xì)胞。因此我們推測β-arrestin2可能參與乳腺癌的多藥耐藥過程，從而干擾β-arrestin2可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥。
　　方法：⑴分別用Q-PCR及Western blot的方法檢測3種乳腺癌細(xì)胞系A(chǔ)DM，MCF-7以及MDA-MB-231中β-arrestin2與MDR1/p-g的表達(dá)情況。⑵乳腺癌敏感細(xì)胞MCF-7及MDA-MB-231分別給予濃度為0，1μmol/L，2.5μmol

6、/L，和5μmol/L的阿霉素作用72h后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行western blot檢測β-arrestin2及MDR1蛋白水平表達(dá)的改變。⑶收集臨床乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行β-arrestin2與MDR1/p-gp的免疫組化染色，并分析兩者之間的關(guān)聯(lián)性。⑷設(shè)計并合成針對β-arrestin2基因的雙鏈干擾RNA序列以及非靶向性干擾序列作為陰性對照，將其定向插入到質(zhì)粒載體pSUPER.neo+GFP中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)載體pSUPER-siβ-arr

7、estin2和pSUPER-siNC; pCDNA3.1-β-arrestin2-GFP全長表達(dá)載體由美國東田納西大學(xué)尹德領(lǐng)教授惠贈。⑸上述質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染3種乳腺癌細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后，分別用Q-PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中β-arrestin2與MDR1/p-gp在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。應(yīng)用MTS法檢測各組細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、順鉑的半數(shù)細(xì)胞致死量的改變。
　　結(jié)果：①對3種乳

8、腺癌細(xì)胞系檢測發(fā)現(xiàn)β-arrestin2在耐藥細(xì)胞ADM中無論mRNA水平還是蛋白水平均較2種敏感細(xì)胞明顯升高，而MDR1/P-gp僅在ADM細(xì)胞中高表達(dá)，敏感株中幾乎不表達(dá)。②MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)后通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)，β-arrestin2及MDR1的蛋白水平呈濃度依賴性升高。③對臨床收集的106例乳腺癌樣本，用免疫組織化學(xué)染色檢測β-arrestin2和MDR1/P-gp的表達(dá)，經(jīng)過分析

9、二者Pearson相關(guān)系數(shù)為0.227，呈低度相關(guān)性且有顯著意義P=0.016。④轉(zhuǎn)染48h后，應(yīng)用Q-PCR檢測各組細(xì)胞中β-arrestin2和MDR1 mRNA水平的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:與對照組相比，β-arrestin2干擾組的β-arrestin2及MDR1mRNA水平均明顯降低。Western blot檢測結(jié)果表明β-arrestin2干擾組細(xì)胞2種蛋白的表達(dá)水平也明顯降低。⑤MTS法檢測各組乳腺癌細(xì)胞對4種化療藥物的耐受性

10、，發(fā)現(xiàn)β-arrestin2干擾組細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和順鉑的半數(shù)細(xì)胞致死量（IC50值）明顯降低，耐藥性被不同程度逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：β-arrestin2與MDR1在乳腺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)具有一定的相關(guān)性，提示β-arrestin2可能通過調(diào)控MDR1的表達(dá)間接影響乳腺癌的多藥耐藥。干擾或過表達(dá)β-arrestin2可以抑制或促進(jìn)MDR1的表達(dá)，從而影響細(xì)胞對化療藥物的耐受性。提示β-arrestin2有可能成為