TRPS1通過調(diào)控多耐藥基因1(MDR1)的表達(dá)影響骨肉瘤多藥耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、[研究背景]
　　骨肉瘤是最常見的骨骼系統(tǒng)原發(fā)的惡性腫瘤，在腫瘤的化學(xué)治療尚未發(fā)明前，預(yù)后非常差。在骨肉瘤的化學(xué)治療中，多藥耐藥的發(fā)生嚴(yán)重的影響了骨肉瘤化療的效果和成功率。多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞對相當(dāng)多的擁有不同的結(jié)構(gòu)或通過不同的靶點起相應(yīng)作用的化療藥物表現(xiàn)出來的耐受性。
　　人類多藥耐藥1(MDR1)編碼一種鑲嵌于細(xì)胞膜上的泵蛋白P-gp，它在腫瘤多藥耐藥過程中起到重要的作用。該蛋白表達(dá)的增多可以導(dǎo)致化療藥物從腫瘤細(xì)胞中外排增

2、強(qiáng)，從而使細(xì)胞對于化療藥物表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目剐?，特別是對于多柔比星和紫杉醇等。
　　毛發(fā)-鼻-趾綜合征基因1(TRPS1)是一個介導(dǎo)毛發(fā)-鼻-趾綜合征(TRPS)的基因，該綜合征具有特征性的軟骨和骨骼的畸形。該基因編碼一段含有9個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它包含一個GATA盒的DNA結(jié)合位點的鋅指蛋白。TRPS1已經(jīng)在某些惡性腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)并且可能在乳腺癌和前列腺癌中具有一定的提示意義。而且另有報道說TRPS1在小鼠成軟骨細(xì)胞A

3、TDC5中促進(jìn)細(xì)胞凋亡和軟骨的發(fā)生。在我們的前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)TRPS1可以在小鼠的胚胎腎臟組織中抑制TGFβ-1的表達(dá)，并且抑制TGFβ的信號傳導(dǎo)通路，而又有相關(guān)報道說明在人的腦部膠質(zhì)瘤中TGFβ-1和TGFβ-2均可抑制MDR1基因的表達(dá)。因而TRPS1也有可能通過調(diào)控MDR1影響多藥耐藥。
　　TRPS1在骨肉瘤中能否調(diào)節(jié)MDR1基因的表達(dá)從而影響多藥耐藥對于改善耐藥骨肉瘤的預(yù)后有重要意義。我們前期在骨肉瘤臨床樣本的研究中

4、觀察到了MDR1和TRPS1具有一定的相關(guān)性。在MDR1基因的固有啟動子區(qū)有三個預(yù)測到的可能于TRPS1結(jié)合的GATA盒相關(guān)序列。我們設(shè)想用攜帶TRPS1基因的siRNA的質(zhì)粒干擾TRPS1基因的表達(dá)可能會導(dǎo)致P-gp糖蛋白的含量的降低，并因此可以部分的逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。
　　在此項研究中，為了明確TRPS1在骨肉瘤細(xì)胞中是否具有調(diào)節(jié)MDR1的作用，我們對三個經(jīng)典的骨肉瘤細(xì)胞株進(jìn)行TRPS1的影響，以期對兩者在功能上的聯(lián)系進(jìn)行評價

5、。我們在一定數(shù)量的骨肉瘤的臨床樣本通過免疫組化進(jìn)一步預(yù)測TRPS1對于預(yù)測MDR1表達(dá)的意義。
　　[研究方法]
　　1.分別用Q-PCR及Westernblot的方法檢測3種骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS，MNNG/HOSC1＃5以及Saos-2中TRPS1及MDR1基因的表達(dá)情況。
　　2.收集臨床未脫鈣骨肉瘤石蠟切片標(biāo)本進(jìn)行TRPS1和MDR1的免疫組化染色，并進(jìn)行統(tǒng)計分析兩者之間的關(guān)聯(lián)性。
　　3.設(shè)計并合成針對

6、TRPS1基因的雙鏈干擾RNA序列以及非靶向性干擾序列作為陰性對照，將其定向插入到質(zhì)粒載體pSUPER.neo+GFP中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)載體pSUPER-siTRPS1和pSUPER-siNC。購買了TRPS1全長克隆載體，酶切并連接于pcDNA3.1上，陰性對照序列同樣連接于其上。測序結(jié)果正確后，大腸桿菌培養(yǎng)質(zhì)粒擴(kuò)增。
　　4.上述質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染3種骨肉瘤細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，通過Q-PCR檢測各組細(xì)胞中TRPS1和MDR

7、1mRNA的表達(dá)情況，Westernblot檢測TRPS1蛋白和P-gp的表達(dá)，應(yīng)用加藥MTT法檢測各組細(xì)胞對多柔比星、順鉑等的半數(shù)細(xì)胞致死量(IC50)的改變，羅丹寧外排實驗觀察P-糖蛋白的外排功能改變，評價TRPS1調(diào)控MDR1對細(xì)胞多藥耐藥性的影響。
　　5.采用U2-OS細(xì)胞并應(yīng)用TRPS1抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗，并以預(yù)測的MDR1啟動子區(qū)結(jié)合位點特異性設(shè)計引物，將共沉淀所得的CDNA片段進(jìn)行相應(yīng)擴(kuò)增，驗證是否有相應(yīng)

8、的結(jié)合位點。
　　6.對U2-OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染了TRPS1相應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)胞系進(jìn)行TFGbeta1的mRNA和蛋白的檢測，以觀察其可能對TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　[實驗結(jié)果]
　　1.對3種經(jīng)典骨肉瘤細(xì)胞系檢測發(fā)現(xiàn)TRPS1在U2-OS，MNNG/HOSCl＃5中表達(dá)量較高，在Saos-2細(xì)胞株中表達(dá)量較少，MDR1在前兩種細(xì)胞中表達(dá)，而在Saos-2中檢測不到蛋白表達(dá)。
　　2.對臨床收集的74例無脫鈣液處理的

9、骨肉瘤樣本中，用免疫組織化學(xué)染色檢測TRPS1為32.4％(24/74)，MDR1陽性率為16.2％(12/74)，經(jīng)過分析二者Pearson相關(guān)系數(shù)為0.478，呈中度相關(guān)性且有顯著意義P＜0.01，在9例骨樣骨瘤標(biāo)本中兩者均為陰性。
　　3.三種細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染TRPS1干擾和全長質(zhì)粒后于其相應(yīng)的陰性對照組檢測發(fā)現(xiàn)，TRPS1及MDR1mRNA和蛋白水平均呈顯著變化，且兩者變化趨勢一致。
　　4.轉(zhuǎn)染48h后，MDR1功能性

10、試驗均有明顯的差異性。用MTT實驗檢測細(xì)胞對4種化療藥的耐受性程度，TRPS1干擾組對多柔比星、順鉑、紫杉醇和5-氟尿嘧啶的耐受性顯著下降，半數(shù)致死量減低，而TRPS1過表達(dá)組則呈現(xiàn)相反趨勢。在羅丹寧外排檢測中，TRPS1干擾組中羅丹明熒光含量均顯著高于對應(yīng)的陰性對照組，熒光強(qiáng)度曲線右移，P-糖蛋白泵出功能降低。過表達(dá)組同樣趨勢相反。
　　5.對U2-OS細(xì)胞株中進(jìn)行的CHIP實驗發(fā)現(xiàn)在其MDR1基因啟動子區(qū)域內(nèi)具有TRPS1轉(zhuǎn)錄

11、因子蛋白的結(jié)合，并且檢測到相應(yīng)的TRPS1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TGFβ-1分子的表達(dá)受到了抑制。
　　[結(jié)論]
　　1.TRPS1與MDR1在骨肉瘤細(xì)胞及組織中均有一定表達(dá)且呈現(xiàn)一定相關(guān)性，提示TRPS1可能通過調(diào)控MDR1的表達(dá)間接影響骨肉瘤的多藥耐藥。干擾或過表達(dá)TRPS1可以抑制或促進(jìn)MDR1的表達(dá)，從而影響細(xì)胞對化療藥物的耐受性。提示TRPS1有可能并有望成為潛在的預(yù)測骨肉瘤耐藥性的指標(biāo)及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的靶點。