轉(zhuǎn)錄因子CUTL1-逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的新靶點(diǎn).pdf

1、【背景】胃癌是嚴(yán)重危害國人健康和生命的惡性腫瘤。胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)分子（P-gp、MRP、LRP、和TopoII等）及本研究所發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的多個(gè)胃癌耐藥相關(guān)分子（PrPc、ZNRD1 等）尚不能完全解釋胃癌的MDR，提示胃癌細(xì)胞中存在著未知的耐藥分子和耐藥機(jī)制。MDR可在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同層次上受到多個(gè)分子的調(diào)控，目前對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究仍不

2、夠徹底，如果繼續(xù)采用傳統(tǒng)單個(gè)基因干預(yù)的研究模式，工作量巨大且不能滿足需要，需要利用高通量的手段，通過多基因調(diào)控的研究模式探討胃癌耐藥機(jī)制。目前的高通量篩選方法包括基因芯片技術(shù)，cDNA文庫和小干擾RNA文庫的構(gòu)建等等。人類基因組有約30,000 個(gè)基因，但轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量卻不超過2,000個(gè)，這就預(yù)示著一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子要調(diào)控多個(gè)下游靶基因，同時(shí)一個(gè)基因也受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控從而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由此可見，轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制在

3、基因表達(dá)調(diào)控中扮演了極其重要的角色，因此轉(zhuǎn)錄因子活性的檢測(cè)對(duì)探究胃癌細(xì)胞的MDR機(jī)制非常有意義，而轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片的問世，則為這方面的研究提供了更加便利的條件。CUTL1 又稱CDP（CCAAT替代蛋白），作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞的生長、分化和發(fā)育調(diào)節(jié)，其和耐藥的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片這一高通量研究方法，進(jìn)行胃癌耐藥調(diào)控機(jī)制的研究，首次提出并證實(shí)CUTL1 轉(zhuǎn)錄因子在胃癌MDR發(fā)生發(fā)展中的重要作用，并利

4、用全基因表達(dá)譜芯片在胃癌細(xì)胞中進(jìn)行CUTL1 通路相關(guān)耐藥基因的篩選。 【目的】通過耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和基因的篩選和驗(yàn)證，為進(jìn)一步闡明胃癌細(xì)胞的MDR 機(jī)制、尋找有效的MDR 逆轉(zhuǎn)措施提供新的理論依據(jù)。 【方法】 (1) 通過MTT 法檢測(cè)耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR 脫藥培養(yǎng)后的藥物敏感性。 (2) 借助轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片，檢測(cè)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和親本細(xì)胞SGC7901 轉(zhuǎn)錄因子活性譜的

5、變化；對(duì)照注釋文件，找出差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。 (3) 借助全基因表達(dá)譜芯片，檢測(cè)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和親本細(xì)胞SGC7901 全基因表達(dá)譜的變化；對(duì)照注釋文件，找出差異表達(dá)的基因。 (4) 利用生物信息學(xué)軟件對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行分類。 (5)利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA 法）對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證。 (6) 構(gòu)建CUTL1 小干擾RNA 表達(dá)載體pSIREN-RetroQ-

6、CUTL1 siRNA1 、pSIREN-RetroQ-CUTL1 siRNA2 和pSIREN-RetroQ 空載體。 (7) 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、克隆篩選等方法，利用pSIREN-RetroQ-CUTL1 siRNA 表達(dá)載體抑制SGC7901 細(xì)胞中CUTL1 的表達(dá)。 (8) 通過Western blot、定量RT-PCR 法、ELISA 和OATFA 法驗(yàn)證上一步實(shí)驗(yàn)。 (9) 通過MTT 法檢測(cè)篩選出的細(xì)胞

7、系對(duì)阿霉素等多種化療藥物的敏感程度。 (10) 利用全基因表達(dá)譜芯片，檢測(cè)CUTL1 敲除細(xì)胞SGC7901/CDPi 及對(duì)照細(xì)胞SGC7901/RetroQ 的基因表達(dá)譜，比較得出兩株細(xì)胞的差異表達(dá)基因。 (11)綜合分析兩張表達(dá)譜芯片結(jié)果，找出轉(zhuǎn)錄因子CUTL1 通路相關(guān)的耐藥分子。 【結(jié)果】 (1) 在芯片注釋文件Matrix 矩陣中查找轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片中表達(dá)差異點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，其中，在SGC

8、7901/ADR 細(xì)胞中表達(dá)下降的轉(zhuǎn)錄因子為：CUTL1/CDP、PTX2、AR、HSF；表達(dá)水平升高的轉(zhuǎn)錄因子為AP-1、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPΔ、AML1、AML2 、AML3 、FOXO1a和E4BP4。其中，CUTL1 活性變化最為明顯，而且其與耐藥的關(guān)系迄今尚未見報(bào)道。 (2) 全基因表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，SGC7901/ADR 細(xì)胞和親本細(xì)胞SGC7901 相比，共有430 個(gè)差異表達(dá)基因。 (

9、3) 利用BIORAG 等生物信息學(xué)軟件，根據(jù)基因的生物學(xué)功能對(duì)430 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類：4％為凋亡相關(guān)基因，4％為細(xì)胞周期相關(guān)基因，3％為黏附相關(guān)基因，2％為免疫調(diào)節(jié)基因，13％的基因在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，11％為細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，8％的基因在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用。在SGC7901/ADR 細(xì)胞表達(dá)明顯變化的基因中，有一部分是已報(bào)道的耐藥相關(guān)分子，它們是：ABCC、ABCC2、ABCC3、CAV1、CAV2、FOL

10、R1、RAC1、PFN2、TOP2A、IL1 A、GAGE1、ABCB1、CYP11A1、ErbB3、ITPR1、EREG、IL6、RAD21、B2M、IL6、FN1、CYR61、GSS、HRG、SR1、C7 和PTGS2。 (4) ELISA 結(jié)果顯示：CUTL1 在SGC7901/ADR 細(xì)胞中表達(dá)明顯下降，與芯片結(jié)果一致。 (5) 構(gòu)建了CUTL1小干擾RNA 表達(dá)載體pSIREN-RetroQ-CUTL1siRN

11、A1 、pSIREN-RetroQ-CUTL1siRNA2 和pSIREN- RetroQ 空載體。 (6) 利用脂質(zhì)體將pSIREN-RetroQ-CUTL1 siRNA1 、pSIREN-RetroQ-CUTL1siRNA2 和pSIREN-RetroQ 空載體轉(zhuǎn)染入SGC7901 細(xì)胞，經(jīng)過約45 天的嘌呤霉素持續(xù)篩選，獲得穩(wěn)定的抗性細(xì)胞SGC7901/CDPi1(pSIREN-RetroQ-CUTL1/CDPsiRNA1

12、 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞) 、SGC7901/CDPi2(pSIREN-RetroQ-CUTL1/CDPsiRNA2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞) 和SGC7901/ RetroQ(pSIREN-RetroQ 空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。 (7) 定量RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果表明,CUTL1mRNA的表達(dá)量在SGC7901/CDPi2 的表達(dá)量是其在SGC7901/ RetroQ細(xì)胞中表達(dá)量的0.5 倍。 (8) Western blot 結(jié)果證實(shí)，

13、 CUTL1 小干擾RNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SGC7901 細(xì)胞后降低了CUTL1 的表達(dá)。 (9) ELISA 結(jié)果顯示，CUTL1 在SGC7901/CDPi2 中的活性與SGC7901/ RetroQ 細(xì)胞相比明顯下降。 (10) OATFA 結(jié)果同樣證明了CUTL1 在SGC7901/CDPi2 中的活性與SGC7901/ RetroQ 細(xì)胞相比明顯下降。 (11)體外藥物敏感性分析結(jié)果顯示，與SGC7901

14、/ RetroQ 細(xì)胞相比， SGC7901/CDPi2 細(xì)胞對(duì)阿霉素等多種化療藥物的敏感性顯著降低。 (12) 全基因表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，SGC7901/CDPi2 細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞SGC7901/RetroQ 細(xì)胞相比，共有54 個(gè)差異表達(dá)基因。其中，CUTL1 上調(diào)的基因有11 個(gè)，CUTL1 下調(diào)的基因有43 個(gè)。綜合分析兩張表達(dá)譜芯片的結(jié)果顯示，CUTL1 下調(diào)的基因CGA、COL4A6、C4.4A、GIP2 和BMP6

15、 在SGC7901/ADR 中表達(dá)明顯升高，即這5 個(gè)基因是CUTL1 通路相關(guān)的耐藥分子。 【結(jié)論】 (1)轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片OATFA是一個(gè)新的高效篩選平臺(tái)，本研究利用OATFA 進(jìn)行胃癌耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選； (2) CUTL1 是一個(gè)在細(xì)胞生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，其與胃癌MDR的關(guān)系尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究首次提出并證實(shí)了CUTL1 在胃癌耐藥發(fā)生發(fā)展中的重要作用：CUTL1 在耐藥細(xì)胞中的