基因轉(zhuǎn)錄、DNA復制及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在基因定點修復中的作用及機制研究.pdf

1、基因治療是目前治愈人類疾病的最根本方法，但因載體安全性差等問題，其臨床應用受到了嚴重限制。要解決這些問題，首先就是要提高治療的靶向性，其中最徹底的方法就是原位修復有缺陷的基因，即基因定點修復，它在靶向性、安全性及操作的方便性方面與基因治療其它方法相比有明顯的優(yōu)勢。目前最有希望的定點修復載體是單鏈寡核苷酸(singlestrandedoligonucleotide，SSO)。以往的工作證實，SSO確有在多系統(tǒng)多層次上完成基因定點修復的能力

2、。但它的主要缺點是修復效率較低，限制了進一步的應用研究。要想提高其修復效率，當務之急就是揭示SSO介導的基因定點修復的作用機制。 本組已經(jīng)構(gòu)建了哺乳動物細胞定點修復的熒光報告系統(tǒng)(F5細胞)，并已篩選出了最佳打靶分子(E6)及最佳轉(zhuǎn)染試劑。當把Thymidine作用于F5細胞后，發(fā)現(xiàn)修復效率顯著提高，因此提出了復制叉滲漏，SSO摻入假說。轉(zhuǎn)錄與復制是兩個密切聯(lián)系的過程，盡管轉(zhuǎn)錄相關(guān)機制研究已取得一定進展，但這些工作都是通過在全基

3、因組范圍內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性而完成的。在這種全局性的調(diào)控方式下，最終修復效率的變化是由多種因素改變引起的，不利于進行機制探討。因此本實驗中我們采用了一種特異性的調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的策略，即以靶基因為模板，合成序列特異性的輔助寡核苷酸。因每一條輔助寡核苷酸都可與靶基因上某段特定區(qū)域的DNA雙鏈中的一條鏈互補配對，進而在這個特定的區(qū)域內(nèi)形成一個loop結(jié)構(gòu)。Loop結(jié)構(gòu)形成后，必然會影響到靶基因的轉(zhuǎn)錄及復制過程，進而導致修復效率的改變。我們選擇了10

4、0nt長和25nt長兩種長度的輔助寡核苷酸分別與E6一起進行修復實驗，發(fā)現(xiàn)兩組實驗的修復效率都有提高。然后，我們把兩段25nt長的輔助寡核苷酸作為一個組合，并采用兩步轉(zhuǎn)染法進行修復實驗，效率提高至對照組的5倍。我們還比較了互補的輔助寡核苷酸的修復效率，結(jié)果顯示兩組的修復效率基本持平。上述實驗結(jié)果均支持我們設(shè)計輔助寡核苷酸的初步設(shè)想，即通過形成loop結(jié)構(gòu)，調(diào)解靶基因的轉(zhuǎn)錄及復制過程，進而改變修復效率。把thymidine和輔助寡核苷酸共

5、同作用于F5細胞后，結(jié)果提示最終的修復效率和只用thymidine時的效率基本持平，以這個結(jié)果為基礎(chǔ)，我們提出了轉(zhuǎn)錄復制偶聯(lián)的修復機制。 丁酸鈉作用于F5細胞，修復效率比對照組提高了3倍。當把丁酸鈉與輔助寡核苷酸共同作用于F5細胞中，結(jié)果顯示修復效率比只用輔助寡核苷酸的實驗組低。針對此結(jié)果，我們認為丁酸鈉即可開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，又可加快轉(zhuǎn)錄速度的特點對定點修復過程既有利又有弊。 本實驗中，定點修復過程依舊表現(xiàn)出明顯的鏈偏向性