空間相鄰染色質(zhì)片段捕獲技術(shù)的建立及其在α-globin基因簇和ApoAV基因座位的應(yīng)用.pdf

1、從染色質(zhì)水平了解基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，基因在基因組中的定位和基因在核內(nèi)空間的定位是基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要調(diào)控水平。對(duì)該層次基因調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)也將有利于我們對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。同時(shí)，基因在基因組上的定位也對(duì)其空間定位有重要影響。生物信息學(xué)對(duì)基因組序列的分析使我們得以了解基因在基因組分布的規(guī)律，然而對(duì)基因在核內(nèi)空間定位的研究手段卻非常局限。最新發(fā)展起來(lái)的染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)使我們得以對(duì)染色質(zhì)的空間組織結(jié)構(gòu)進(jìn)

2、行直接的研究。例如，已經(jīng)用該方法證明遠(yuǎn)距離的調(diào)控序列可以通過(guò)將間隔序列環(huán)出而與被調(diào)控基因啟動(dòng)子發(fā)生直接的相互作用。更為重要的是，也有研究利用該方法驗(yàn)證了染色體間的功能元件間的相互作用。 非常局限的是，染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)目前只能應(yīng)用到驗(yàn)證可能的染色質(zhì)間相互作用。事實(shí)上，更多的染色質(zhì)問(wèn)連接是不可能在現(xiàn)有的研究背景下被預(yù)測(cè)的。因此，為了尋找到可能的未知染色質(zhì)間連接，我們通過(guò)創(chuàng)建一種新的相鄰染色質(zhì)捕獲技術(shù)(ACT)結(jié)合相鄰染色質(zhì)定量分析

3、技術(shù)(QACC)嘗試尋找給定染色質(zhì)片段的所有高頻率連接片段。在3C模板的基礎(chǔ)上，我們用另外一個(gè)識(shí)別序列較短的酶對(duì)其進(jìn)行酶切，以獲得兩端均為該酶切點(diǎn)的雜合片段。這些雜合片段在較大體積的連接體系中進(jìn)行自連接環(huán)化，然后以巢式反向PCR獲得與特異連接的片段群。我們首先獲得了小鼠α-珠蛋白基因簇主增強(qiáng)子元件HS26為引領(lǐng)片段的雜合片段群，以MmeI從該片段群中的每個(gè)片段上切下19～20bp的Tags，連接為串聯(lián)體后測(cè)序。通過(guò)比較分析這些Tags的

4、出現(xiàn)頻率，就可以評(píng)估這些Tags所代表的染色質(zhì)片段與HS26連接的頻率，從而確定這些片段與HS26的空間位置關(guān)系。我們總共得到超過(guò)300個(gè)Tags的序列，其中有218個(gè)片段通過(guò)BLASTn的方法定位到小鼠基因組上。結(jié)果分析表明，絕大部分的Tags是定位到小鼠α-珠蛋白基因簇上的?？偟膩?lái)看，這些捕獲的片段的出現(xiàn)頻率與我們以前報(bào)道的以經(jīng)典3C方法研究α-珠蛋白基因簇染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)果是一致的。例如，我們捕獲的α1和α2基因的啟動(dòng)子區(qū)的頻率是2

5、8次。另外兩個(gè)重要的調(diào)控元件HS21和HS8的捕獲頻率分別是16次與3次。對(duì)于HS26上游的其它HS位點(diǎn)，我們均未檢測(cè)到。因此說(shuō)明HS26與另外兩個(gè)調(diào)控元件HS21和HS8共同作用在14.5天的小鼠胎肝造血細(xì)胞中調(diào)控α1和α2的表達(dá)。HS26與HS21、HS8、α1和α2的啟動(dòng)子區(qū)的連接頻率也與我們以前報(bào)道的3C方法的結(jié)果一致。另外，由α-珠蛋白與其上游的看家基因形成轉(zhuǎn)錄工廠的結(jié)果也得到了驗(yàn)證。我們檢測(cè)到了MPG基因啟動(dòng)子區(qū)和Mare基

6、因啟動(dòng)子區(qū)以一定的頻率與HS26發(fā)生了連接。有趣的是，我們還通過(guò)測(cè)序的結(jié)果直接推斷出了HS26所在的NcoI片段形成了Loop的結(jié)構(gòu)。 另外一個(gè)更為重要的結(jié)果是我們?cè)讦?珠蛋白基因簇的上游約500kb處發(fā)現(xiàn)了一個(gè)較高頻率的片段475A8。生物信息學(xué)分析表明該片段上富含GATA-1，SATB1的結(jié)合位點(diǎn)，并且含有至少一個(gè)NF-E2的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步的3C分析表明該片段在小鼠的胎肝和MEL細(xì)胞中均以較高的頻率與α1和α2的啟動(dòng)子區(qū)相

7、連接。這表明該片段可能是一個(gè)高度保守的在α-珠蛋白基因表達(dá)中有重要作用的調(diào)控片段。為了鑒定該片段的功能，我們利用報(bào)告基因來(lái)研究該片段對(duì)α-珠蛋白基因在MEL細(xì)胞中的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，在未誘導(dǎo)分化的MEL細(xì)胞中，該片段可以強(qiáng)烈抑制珠蛋白基因的啟動(dòng)子，而在發(fā)生誘導(dǎo)分化的MEL細(xì)胞中，該抑制作用消失。因此，我們以一個(gè)模型來(lái)說(shuō)明475A8在成年期紅系細(xì)胞分化中的作用。在分化的早期階段，475A8通過(guò)環(huán)的方式接近α1和α2基因的啟動(dòng)子區(qū)，抑制其

8、表達(dá)，但是在發(fā)生分化后，由于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的活性變化，可能導(dǎo)致了475A8上結(jié)合的抑制因子減少，從而喪失了抑制活性。但是有趣的是475A8似乎并沒(méi)有離開(kāi)原來(lái)的位置。 我們另外還選擇了ApoAⅤ基因的啟動(dòng)子區(qū)作為引領(lǐng)片段，對(duì)與之可能發(fā)生連接的片段進(jìn)行了尋找。ApoAⅤ基因是ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇的一員。BAC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的研究卻發(fā)現(xiàn)該基因并不接受ApoCⅢ增強(qiáng)子的調(diào)控。我們總共獲得超過(guò)200個(gè)染色質(zhì)片段。有意思的是，這

9、些被捕獲的片段主要是來(lái)源于其它的染色體而且分布均一。沒(méi)有任何來(lái)源于ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇的片段被捕獲，也沒(méi)有任何片段被捕獲的頻率能顯著的高出其它片段。因此，我們認(rèn)為ApoAⅤ可能是環(huán)出了ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇而參與到了另外一個(gè)有許多來(lái)源于不同染色體基因組成的轉(zhuǎn)錄工廠，以維持其基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。 對(duì)α-珠蛋白基因簇HS26相連接片段和ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇ApoAⅤ基因啟動(dòng)子相連接片段的比較分析表