分枝桿菌感染免疫應(yīng)答中巨噬細(xì)胞極化分型和多核巨細(xì)胞形成及功能的研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞在機(jī)體對(duì)抗分枝桿菌感染的固有免疫和適應(yīng)性免疫中都有重要的作用。巨噬細(xì)胞是一種多功能、可塑性強(qiáng)的免疫細(xì)胞。巨噬細(xì)胞吞噬分枝桿菌后可以分泌細(xì)胞因子、趨化因子，招募更多免疫細(xì)胞，并將分枝桿菌抗原呈遞給淋巴細(xì)胞，激活適應(yīng)性免疫。巨噬細(xì)胞根據(jù)表型和功能可分為兩種極化類型:M1型和M2型。前者主要由Th1型細(xì)胞因子如IFNγ， TNF-α等和一些來(lái)源于麻風(fēng)、結(jié)核分枝桿菌或其他病原體的LPS、脂蛋白等激活產(chǎn)生;后者與Th2型細(xì)胞因子的反應(yīng)相關(guān)

2、， IL-3和IL-4、IL-10、TGF-β、糖皮質(zhì)激素等激活產(chǎn)生。M1能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)菌的清除，而后者主要抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)和重塑組織。由于分枝桿菌可通過免疫逃逸而能長(zhǎng)期存在巨噬細(xì)胞中，引起機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)，形成肉芽腫結(jié)構(gòu)，并融合形成多核巨細(xì)胞。巨噬細(xì)胞向多核巨細(xì)胞的演變和分化是分枝桿菌感染等慢性炎癥性疾病的一個(gè)重要特征，但其機(jī)制和功能還不清楚。
　　第一章:評(píng)價(jià)不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)不同多核巨細(xì)胞形成的能力。通過瑞氏吉姆薩

3、染色法觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)算各組細(xì)胞的融合率，發(fā)現(xiàn)GM-CSF聯(lián)合IFN-γ或IL-4能夠促進(jìn)多核巨細(xì)胞的形成，IL-3有與GM-CSF相似的作用;GM-CSF和IL-3單獨(dú)對(duì)多核巨細(xì)胞的形成影響不大。GM-CSF聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)形成的多核巨細(xì)胞在形態(tài)上與朗漢斯巨細(xì)胞在形態(tài)上相似，而GM-CSF聯(lián)合IL-4能夠促進(jìn)異物多核巨細(xì)胞的形成。分枝桿菌感染所致的多核巨細(xì)胞多呈朗格漢斯巨細(xì)胞，因此GM-CSF聯(lián)合IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞而獲得朗漢斯巨

4、細(xì)胞可作為研究分枝桿菌與多核巨細(xì)胞相互作用的模型。
　　第二章:探索不同來(lái)源的多核巨細(xì)胞的形成機(jī)制。已有研究發(fā)現(xiàn)若干與細(xì)胞融合相關(guān)的基因。我們通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)不同細(xì)胞因子刺激下的多核巨細(xì)胞形成過程中重要的融合基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PIK3cb、Tm7sf4、Osp等融合因子可能與在某個(gè)時(shí)期促進(jìn)朗漢斯巨細(xì)胞的形成有關(guān)，而CD36、Tm7sf4、可能與IL-4誘導(dǎo)的異物巨細(xì)胞形成有關(guān)系，Tm7sf4、PIK3cb與麻風(fēng)桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞融合

5、有關(guān)。
　　第三章:研究巨噬細(xì)胞在形成多核巨細(xì)胞過程中的極性分化以及不同極型細(xì)胞的分泌功能。通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況，應(yīng)用ELISA測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的分泌情況。研究結(jié)果表明，GM-CSF+IFN-γ組主要表達(dá)和分泌Th1型細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α，在細(xì)胞培養(yǎng)晚期， IL-10基因表達(dá)增高。此外，GM-CSF+IFN-γ組細(xì)胞還分泌與細(xì)胞融合相關(guān)的IL-15。GM-CSF

6、+IL-4組細(xì)胞主要表達(dá)和分泌Th2型細(xì)胞因子IL-10，細(xì)胞培養(yǎng)晚期GM-CSF+IL-4組細(xì)胞IFN-γ、TL-1β、TNF-α的表達(dá)和分泌增高。本研究通過流式細(xì)胞技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)第10天GM-CSF+IFN-γ和GM-CSF+IL-4兩組細(xì)胞中同時(shí)有M1和M2型巨噬細(xì)胞。因此巨噬細(xì)胞的分泌功能與其本身的極化分型和功能有密切的關(guān)系。麻風(fēng)桿菌刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌Th1細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1β和Th2細(xì)胞因子I

7、L-10，還可以分泌融合相關(guān)的IL-15，說(shuō)明麻風(fēng)桿菌感染的免疫中M1和M2細(xì)胞同時(shí)存在，兩者的平衡與感染的預(yù)后有關(guān)。
　　第四章:探索不同因子刺激下巨噬細(xì)胞及多核巨細(xì)胞吞噬功能和殺菌功能的變化。我們通過激光共聚焦技術(shù)直接觀察細(xì)胞吞噬細(xì)菌的作用，發(fā)現(xiàn)GM-CSF聯(lián)合IL-4誘導(dǎo)的M2型細(xì)胞及異物巨細(xì)胞有較強(qiáng)的吞噬能力，通過菌落培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)GM-CSF聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)而來(lái)的M1細(xì)胞朗漢斯巨細(xì)胞有較強(qiáng)的殺菌能力，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，殺菌能

8、力減弱。
　　總之，本研究通過GM-CSF聯(lián)合IFN-γ成功誘導(dǎo)形成了LGCs，與麻風(fēng)桿菌誘導(dǎo)的LGCs相比，除了形態(tài)上相似外，本研究首次發(fā)現(xiàn)兩者在功能和形成機(jī)制上也有很多共同特點(diǎn)。驗(yàn)證了GM-CSF聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)形成M1細(xì)胞，融合成LGCs，主要分泌Th1細(xì)胞因子;GM-CSF聯(lián)合IL-4誘導(dǎo)形成M2細(xì)胞，融合成FBGCs，主要分泌Th2細(xì)胞因子。對(duì)比了兩者的吞噬、殺菌能力;前者能有效殺滅細(xì)菌，但吞噬能力弱;后者能夠吞噬大量