丙戊酸鈉聯(lián)合雌激素對去卵巢癡呆小鼠的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　研究雌激素缺乏不同時(shí)間段癡呆模型小鼠腦內(nèi)雌激素受體（Estrogen receptors,ERs）及糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β）的動(dòng)態(tài)變化，并觀察丙戊酸鈉(valproic acid sodiumsalt，VPA)聯(lián)合雌激素對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因去勢AD模型小鼠腦內(nèi)雌激素受體含量及GSK-3β相關(guān)信號通路的影響，探討相關(guān)的作用機(jī)制。本課題研究成果將為進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)

2、制及臨床上研究和開發(fā)治療AD的多靶向藥物提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法：
　　本課題分兩部分進(jìn)行。第一部分：選取3月齡雌性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只，將其隨機(jī)分為假手術(shù)組(AD-Sham組)和手術(shù)組(AD-OVX組)，同月齡野生型小鼠為對照組(WT組)，每組10只。分別于術(shù)后1個(gè)月和術(shù)后5個(gè)月，采用多種方法檢測小鼠外周血雌激素水平、行為學(xué)、腦組織形態(tài)學(xué)及相關(guān)蛋白的變化。
　　第二部分：選取去勢后1個(gè)月癡呆模型小鼠

3、進(jìn)行藥物治療,隨機(jī)平均分為6組：生理鹽水對照組、VPA藥物處理組、E2藥物處理組、Liq藥物處理組、VPA聯(lián)合E2藥物處理組及VPA聯(lián)合Liq藥物處理組，每組8只。VPA藥物處理組小鼠給予藥物VPA30mg/kg·d，雌激素藥物處理組給予E2藥物2.4ug/只·d，Liq治療組給予Liq50ug/kg·d,VPA和E2聯(lián)合治療組給予VPA30mg/kg·d和E22.4ug/只·d，VPA和Liq聯(lián)合治療組給予VPA30mg/kg·d和L

4、iq50ug/kg·d,生理鹽水治療組給予等量生理鹽水，除Liq給藥方式為灌胃外，其余給藥均為腹腔注射。
　　藥物處理1個(gè)月后，采用高架十字迷宮及曠場實(shí)驗(yàn)以檢測各組小鼠的抑郁焦慮行為；Morris水迷宮檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力；利用蛋白印跡（Western blot）等技術(shù)，檢測聯(lián)合用藥對小鼠腦內(nèi)雌激素受體含量，GSK-3β活性及老年斑的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：OVX1個(gè)月和

5、5個(gè)月組AD小鼠體循環(huán)雌激素水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；OVX1個(gè)月組小鼠子宮無明顯縮小，而OVX5個(gè)月出現(xiàn)明顯萎縮。Morris水迷宮顯示，OVX1個(gè)月后，與AD-Sham組相比，AD-OVX組小鼠找到平臺的逃避潛伏期和路程顯著增加(P＜0.05)，跨越平臺的次數(shù)明顯減小(P＜0.05)。隨著OVX時(shí)間的延長，至OVX5個(gè)月后，AD-OVX組小鼠找到平臺的時(shí)間和經(jīng)過的路程更進(jìn)一步延長(P＜0.05)，跨越平臺的次數(shù)也相應(yīng)下降(P＜0

6、.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，與AD-Sham組相比，AD-OVX1個(gè)月和5個(gè)月組小鼠腦內(nèi)老年斑均顯著增加(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與AD-Sham組相比，AD-OVX1個(gè)月及5個(gè)月組小鼠腦內(nèi)ERβ蛋白水平出現(xiàn)進(jìn)行性下調(diào)(P＜0.05)；相應(yīng)地，AD-OVX組小鼠腦內(nèi)p-GSK-3β水平降低的趨勢與ERβ一致(P＜0.05)，盡管正常小鼠和AD小鼠腦內(nèi)GSK-3β總蛋白無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.

7、第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、行為學(xué)
　　1）高架十字迷宮檢測結(jié)果顯示：聯(lián)合藥物處理組小鼠在開放臂活動(dòng)次數(shù)明顯增多（P＜0.05），聯(lián)合藥物處理組在開放臂停留的時(shí)間與其余各組相比均明顯延長（P＜0.01）。在開放臂活動(dòng)次數(shù)及開放臂停留時(shí)間的比率上，VPA與E2聯(lián)合處理組均明顯增加（P＜0.01），Liq處理組也明顯增加（P＜0.05）；VPA與E2，VPA與Liq聯(lián)合處理組較VPA及E2單獨(dú)藥物處理組也顯著增加（P＜0.05）

8、。
　　2）水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果：可視平臺條件下，各組藥物處理小鼠找到平臺的時(shí)間和路程均無明顯的差異（P＞0.05）。隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)條件下，其他各藥物處理組小鼠找到隱蔽平臺的游動(dòng)時(shí)間及路程與生理鹽水對照組相比均明顯縮短（P＜0.05）；而聯(lián)合藥物處理組游動(dòng)時(shí)間及距離更加縮短（P＜0.05）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組比較，聯(lián)合藥物處理組穿越平臺的次數(shù)明顯增多（P＜0.01），單一藥物處理組也明顯增多（P＜0.05）；與聯(lián)合藥物處理組比較

9、，VPA處理組和Liq處理組均明顯減少（P＜0.05），E2處理組顯著減少（P＜0.01）。
　　2、各組小鼠子宮形態(tài)及重量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：各藥物處理組小鼠子宮在外觀形態(tài)上均有不同程度的增大，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果得出，VPA組，Liq組與Control組相比，子宮重量無明顯變化（P＞0.05）;E2組，VPA+E2組，VPA+Liq與Control組相比，子宮重量顯著增加（P＜0.01）。E2組，VPA+E2組小鼠子宮形態(tài)與其余各組相比明顯

10、增生，重量也顯著增加（P＜0.05）,并有大小形狀不一的結(jié)節(jié)形成。3.蛋白水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）雌激素受體α與β與生理鹽水組比較，大腦皮質(zhì)區(qū)ERα蛋白含量在聯(lián)合藥物處理組中顯著上升（P＜0.01），在各單獨(dú)藥物處理組中無明顯差異（P＞0.05）。與生理鹽水對照組相比，大腦海馬區(qū)ERα蛋白水平在VPA藥物處理組中無明顯變化（P＞0.05），在其余各藥物處理組中均顯著增多（P＜0.05）。在ERβ含量的比較中，與生理鹽水對照組相比

11、，其余各藥物處理組大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)內(nèi) ERβ含量均顯著增多（P＜0.05），且聯(lián)合藥物處理組大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)內(nèi)ERβ的含量比各藥物單獨(dú)處理組明顯增多（P＜0.05）。
　?。?）GSK-3β活性檢測：與生理鹽水對照組相比，其余各單獨(dú)藥物處理組小鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)GSK-3β總蛋白水平均無明顯差異（P＞0.05），聯(lián)合藥物處理組腦皮質(zhì)區(qū)GSK-3β總蛋白水平顯著下降（P＜0.05），而腦海馬區(qū)內(nèi)GSK-3β總蛋白水平無明顯差異（P＞0

12、.05）。其第9位點(diǎn)磷酸化水平標(biāo)志著GSK-3β活性的高低，與生理鹽水對照組相比，VPA組、E2組腦皮質(zhì)區(qū)pSer9-GSK-3β水平均無明顯差異（P＞0.05），Liq組及聯(lián)合藥物處理組腦皮質(zhì)區(qū)pSer9-GSK-3β水平明顯升高（P＜0.05）；而在各組腦海馬區(qū)pSer9-GSK-3β水平的比較中，與生理鹽水對照組相比，其余各藥物處理組pSer9-GSK-3β水平均明顯升高（P＜0.05），且與各單獨(dú)藥物處理組相比，聯(lián)合藥物處理組p

13、Ser9-GSK-3β水平也顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、卵巢切除手術(shù)后，AD小鼠體循環(huán)雌激素水平隨年齡增長呈下降趨勢，子宮形態(tài)隨年齡增長逐漸萎縮。
　　2、卵巢切除手術(shù)后，AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力隨年齡增長逐漸下降。
　　3、卵巢切除手術(shù)后，AD小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積及老年斑的形成增多，其可能機(jī)制可能是與ERβ含量下降所導(dǎo)致的GSK-3β活性異常有關(guān)。
　　4、藥物處理明顯改善了去勢AD小鼠