根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的千年桐SAD基因?qū)Ξa(chǎn)油酵母的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、微生物油質(zhì)資源的開發(fā)利用是解決能源危機(jī)的重要新途徑之一。但微生物生產(chǎn)油脂成分復(fù)雜，難以滿足生物柴油對(duì)長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的要求。植物中的△9硬脂酰-ACP脫飽和酶（Stearoyl-ACP desaturase，SAD）催化在第9-10碳原子之間脫氫形成脂肪酸的第一個(gè)雙鍵，直接決定植物儲(chǔ)脂中不飽和脂肪酸的比例。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用外源基因調(diào)控生物代謝的研究受到關(guān)注，這無疑為產(chǎn)油菌種改良，指明了一個(gè)新的途徑。本實(shí)驗(yàn)室克隆到了

2、優(yōu)良油料樹種千年桐的SAD基因，并構(gòu)建了該基因的真菌表達(dá)載體pCAM2300-sad，期望通過將其導(dǎo)入產(chǎn)油真菌，調(diào)控其油脂代謝途徑來提高產(chǎn)油菌油脂品質(zhì)。
　　本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，對(duì)產(chǎn)油酵母淺白隱球酵母進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，并對(duì)農(nóng)桿菌菌株，農(nóng)桿菌及酵母農(nóng)濃度，共培養(yǎng)時(shí)間，共培養(yǎng)期 AS濃度等影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因子進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：利用農(nóng)桿菌菌株AGL-1介導(dǎo)，農(nóng)桿菌濃度為1×109個(gè)細(xì)胞/mL，酵母濃度為5×106至1×107個(gè)細(xì)

3、胞/mL，在含有AS200μmol/L條件下共培養(yǎng)48h可獲得較高的轉(zhuǎn)化率。PCR及RT-PCR檢測(cè)表明，SAD基因已成功轉(zhuǎn)入淺白隱球酵母中，并能在淺白隱球酵母受體中轉(zhuǎn)錄成 mRNA。對(duì)轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定生物量及油脂含量，得到油脂產(chǎn)量高于對(duì)照的菌株一株，編號(hào)E-2，其油脂產(chǎn)量為1.74 g/L，油脂含量為16.19g/L，分別提高了14.47％和9.39%。對(duì)9個(gè)轉(zhuǎn)化子油脂脂肪酸組成進(jìn)行氣相色譜分析，油酸含量差距顯著，其中有3

4、株油酸比例高于對(duì)照，2株低于對(duì)照，4株變化不明顯。其中X-1油酸比例最高，比對(duì)照提高了14.4%，同時(shí)棕櫚酸比例下降了18.75%。
　　同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中對(duì)載體pCAM2300-sad進(jìn)行改造，構(gòu)建了含Zeocin篩選標(biāo)記基因的載體pCAM2300-sadz，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)優(yōu)良產(chǎn)油酵母斯達(dá)氏油脂酵母進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，初步獲得了一些轉(zhuǎn)化子。
　　本文通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)了 SAD基因?qū)\白隱球酵母和膠粘紅酵母中的遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得