Caenorhabditis elegans CDC-42與PAR極性蛋白之間的相互作用及其對(duì)壽命的影響.pdf

1、CDC—42屬于Rho家族中的類Ras GTP酶成員。本文通過(guò)RNA干擾、CDC—42的表達(dá)與純化、免疫定位、壽命檢測(cè)和免疫共沉淀這5個(gè)方面，利用模式生物C．elegans對(duì)cdc—42的定位及其功能進(jìn)行了研究。 通過(guò)干擾之后我們發(fā)現(xiàn)cdc—42對(duì)于早期胚胎細(xì)胞分裂的極性有一定影響。并且能夠調(diào)控PAR-2和PAR—6的定位，有可能調(diào)控PAR—3定位，對(duì)PAR—5沒(méi)有影響。 利用PET表達(dá)了重組CDC—42，我們對(duì)其表達(dá)條

2、件進(jìn)行了優(yōu)化，并大量表達(dá)、純化了CDC—42，免疫小鼠得到抗血清，檢測(cè)效價(jià)，在野生型和par突變體蟲體中利用Western blot檢測(cè)了CDC—42的含量，發(fā)現(xiàn)在par—4突變體中CDC—42表達(dá)減少，其它突變體中也有變化。 通過(guò)對(duì)CDC—42在野生型和par突變體胚胎中的免疫定位研究，發(fā)現(xiàn)在野生型胚胎1細(xì)胞時(shí)期精核和卵核還沒(méi)融合時(shí)，CDC—42均勻的分布在細(xì)胞質(zhì)中。到了2、4細(xì)胞時(shí)期，CDC—42依然均勻的分布在細(xì)胞質(zhì)中。前

3、期染色較為明亮。后期胚胎細(xì)胞中， CDC—42在外周細(xì)胞中表達(dá)較多。在快形成蟲體時(shí)，CDC—42在外周皮層富集。在par基因突變后，CDC—42在胚胎中的表達(dá)量都有所下降。在par-2突變體(KK114)和par—6突變體(KK818)胚胎中表現(xiàn)的尤為明顯，證明par-2和par—6可以調(diào)控cdc—42。par—1突變體(KK288)中CDC—42的表達(dá)減少但一直維持恒定，表明par—1對(duì)cdc—42的影響是持續(xù)的，并且不可恢復(fù)。在pa

4、r—3突變體(KK237)、par—4突變體(KK300)、par—5突變體(KK299)胚胎中，CDC—42的表達(dá)量初期很少，但隨著胚胎細(xì)胞數(shù)目增加，表達(dá)量也出現(xiàn)恢復(fù)。意味著它們可能只是間接影響CDC—42的表達(dá)。 利用cdc—42的RNA干擾食物對(duì)C．elegans進(jìn)行干擾并檢測(cè)其壽命，發(fā)現(xiàn)野生型蟲體cdc—42 RNA干擾后壽命沒(méi)有顯著性變化，說(shuō)明干擾cdc—42對(duì)野生型線蟲的壽命沒(méi)有影響。daf-2突變體線蟲在cdc—4

5、2 RNA干擾后平均壽命縮短2.9天，縮短了23.8％。daf—16突變體線蟲在cdc—42 RNA干擾后壽命相對(duì)突變體平均壽命縮短0.75天，說(shuō)明喂食cdc—42 RNA干擾食物可以有效縮短daf—16突變體的平均壽命，平均壽命縮短10％。與野生型壽命相比較，daf-2突變情況下壽命有所延長(zhǎng)，而在daf—16突變下壽命會(huì)變短。cdc—42干擾后，雖然野生型壽命沒(méi)有改變，但daf-2和daf—16突變體壽命明顯縮短。兩個(gè)突變體的平均壽命