超嗜熱古菌真核同源的Orc1-Cdc6蛋白與復(fù)制原點(diǎn)之間的相互作用研究.pdf

1、極端嗜熱古菌硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus P2)含有三個(gè)有活性的復(fù)制原點(diǎn)和三個(gè)真核類似的Orc1/Cdc6蛋白(命名為SsoCdc6-1， SsoCdc6-2和SsoCdc6-3)，因此成為研究真核生物復(fù)雜DNA復(fù)制機(jī)制的理想材料。但是目前還不清楚古菌的這種多個(gè)Orc1/Cdc6蛋白之間能否通過(guò)功能性的相互作用共同來(lái)調(diào)控DNA復(fù)制起始。本研究采用純化的復(fù)制起始蛋白SsoCdc6及其突變體，在體外比較研究

2、了它們與兩個(gè)復(fù)制原點(diǎn)DNA之間的相互作用，特別是首次對(duì)古菌的多個(gè)SsoCdc6蛋白相互調(diào)控它們與原點(diǎn)DNA的相互作用進(jìn)行了系統(tǒng)的生化分析。本研究主要取得了以下幾個(gè)方面的結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建了SsoCdc6-2蛋白和SsoCdc6-2的C-末端缺失體(SsoCdc6-2△C)的大腸桿菌表達(dá)菌株，并通過(guò)熱處理和Ni-NTA鎳瓊脂糖凝膠親和純化等步驟獲得純度達(dá)99％以上的SsoCdc6蛋白和SsoCdc6△C蛋白；針對(duì)S.solfa

3、taricus復(fù)制原點(diǎn)oriC1和oriC2的結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)了分別包括分叉和平端兩種結(jié)構(gòu)的三組特異性DNA底物。這些底物的共同特征是含有相互重疊的SsoCdc6結(jié)合位點(diǎn)。
　　 2.通過(guò)一系列電泳遷移率改變實(shí)驗(yàn)(EMSA)，發(fā)現(xiàn)SsoCdc6-1能夠刺激SsoCdc6-2和SsoCdc6-3的DNA結(jié)合活性；相反，SsoCdc6-3抑制SsoCdc6-1與DNA底物的結(jié)合。而且它們的C-末端缺失體(SsoCdc6△C)基本保留了

4、這種類似的調(diào)控功能。因此，三個(gè)SsoCdc6蛋白能夠相互調(diào)控(正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控)各自對(duì)原點(diǎn)特異性DNA的結(jié)合。
　　 3.采用Pull-down/Western blot分析，發(fā)現(xiàn)了如下幾組蛋白間物理性的相互作用：SsoCdc6-1/SsoCdc6-3，SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-3，SsoCdc6-1/SsoCdc6-2，SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-2，SsoCdc6-2/SsoCdc6-3，SsoCd

5、c6-2/SsoCdc6-3△C。另外，采用細(xì)菌雙雜交技術(shù)，檢測(cè)到了三個(gè)SsoCdc6蛋白與另一個(gè)復(fù)制起始蛋白SsoMCM均能發(fā)生物理的相互作用。
　　 4.構(gòu)建了SsoCdc6-2蛋白WalkerA模體的定點(diǎn)突變體(SsoCdc6-2KA)的大腸桿菌表達(dá)菌株，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件獲得了重組蛋白。進(jìn)一步的EMSA實(shí)驗(yàn)表明，SsoCdc6-2KA保留了結(jié)合DNA的特性但失去了自磷酸化的功能。
　　 DNA復(fù)制過(guò)程是個(gè)十分復(fù)雜的