中度嗜熱菌中PprⅠ同源蛋白DG0395的研究.pdf

1、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans)以具有極強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力而著稱(chēng)，是研究DNA損傷修復(fù)的理想模式生物。pprI是耐輻射球菌體內(nèi)的一個(gè)重要的DNA修復(fù)開(kāi)關(guān)基因，通過(guò)直接或間接的調(diào)控一系列通路來(lái)加強(qiáng)DNA修復(fù)能力。研究表明，pprI能夠調(diào)控氧化應(yīng)激、能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白折疊和組裝等途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使細(xì)胞生存。在此基礎(chǔ)上，本文對(duì)PprI蛋白在中度嗜熱菌（Deinococcus geoth

2、ermalis）中的同源物DG0395進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示:
　　1.從中度嗜熱菌中克隆dg0395基因，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株中。
　　2.優(yōu)化DG0395蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件，并通過(guò)AKTA純化系統(tǒng)純化得到了該蛋白。
　　3.體外活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DG0395具有與PprI相同的金屬酶活性，底物同樣為DdrO;最適酶切溫度為55℃，而PprI的最適酶切溫度45℃;PprI與DG0395酶切的最適合P

3、H都為8.0;之前研究發(fā)現(xiàn)Mn2+能激活PprI的酶切活性，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DG0395的酶切活性同樣能被Mn2+激活。
　　4.在pprI缺失株YR1的基礎(chǔ)上構(gòu)建了pprI補(bǔ)償株YR1-PprI和dg0395補(bǔ)償pprI功能株YR1-DG0395。與野生株R1相比，PprI缺失突變株YR1在電離輻射照射，紫外照射，過(guò)氧化氫處理下，生存率大大下降，而PprI補(bǔ)償株YR1-PprI和DG0395補(bǔ)償PprI功能株YR1-DG0395與野生

4、型差別不大，說(shuō)明DG0395在體內(nèi)具有PprI相似作用，能補(bǔ)償Ppr的功能。
　　5.分別測(cè)定了野生型菌株R1和PprI突變株YR1以及PprI補(bǔ)償株YR1-PprI與DG0395補(bǔ)償株YR1-DG0395的生長(zhǎng)速度，并通過(guò)菌斑實(shí)驗(yàn)比較了四個(gè)菌株在不同溫度下生長(zhǎng)速度的差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，PprI在耐輻射球菌體內(nèi)行使與生長(zhǎng)有關(guān)的功能，DG0395能補(bǔ)償其功能，但DG0395補(bǔ)償株YR1-DG0395更適合在45℃高溫下生長(zhǎng)。