革蘭氏陽性中度嗜鹽菌鈉離子輸出相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、中度嗜鹽菌能適應(yīng)很寬的鹽濃度范圍，具有特殊的遺傳特性和代謝機制，其中鈉離子輸出系統(tǒng)在維持細胞正常的鹽濃度和pH穩(wěn)態(tài)等生命活動過程中扮演十分重要的角色。本研究以大腸桿菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因缺陷株EscherichiacoliKNabc為宿主，通過功能互補方法，從革蘭氏陽性中度嗜鹽菌達坂喜鹽芽孢桿菌(Halobacillusdabanensis)D-8克隆得到兩個新基因，即一個Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因nhaH和一個初級鈉泵基因n

2、ap。其中，nhaH預(yù)測編碼含403個氨基酸、具有12個推測跨膜區(qū)的蛋白，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白NhaG存在最高(54％)的同源性。nhaH能增強KNabc菌株對NaCl和堿性pH的抗性。攜帶nhaH基因的KNabc菌株具有pH依賴性的Na+/H+和Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性，其活性的最適pH分別為9.0和8.5。nhaH是從中度嗜鹽菌中獲得的第一個Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因。

3、nap基因編碼的蛋白與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的NADH脫氫酶有56％的同源性，與耐鹽芽孢桿菌(Bacillushalodurans)的NADH氧化酶存在55％的同源性。攜帶nap基因的大腸桿菌(E.coli)KNabc對解偶聯(lián)劑碳酰氰化物對氯苯腙(CCCP)具有抗性，由其制備的反轉(zhuǎn)膜具有次級Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性。同時，nap還能增強E.coli呼吸鏈缺陷株ANN0222在堿性條件下的生長能力。以上結(jié)論表明，

4、Nap具有初級Na+泵和次級Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的雙重特性。迄今為止，在分子水平上，還沒有關(guān)于極端微生物初級Na+泵的研究報道。 采用PCR方法，敲除編碼NhaH蛋白C末端親水區(qū)域9個氨基酸的27個堿基后，所獲得的nhaH△C互補KNabc的能力明顯低于nhaH。NhaH△C的Na+/H+和Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性明顯低于NhaH，而且Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的活性向酸端偏移，表明NhaH蛋白C末端親水區(qū)與活性和pH感應(yīng)

5、均有關(guān)。 對NhaH跨膜區(qū)保守的6個帶電荷殘基(D、E和R)以及位于TMⅢ-TMⅣ之間的2個H進行定點突變。耐鹽性實驗表明，攜帶D137A、D166A、R325A、D137AR325A和D166AR325A5種突變質(zhì)粒的E.coliKNabc菌株不能在含0.2MNaCl的LBK培養(yǎng)基上生長，其余突變質(zhì)粒互補E.coliKNabc的能力與突變前無明顯區(qū)別?；钚詼y定結(jié)果表明，由突變質(zhì)粒D137A、D166A、R325A、D137AR

6、325A以及D166AR325A轉(zhuǎn)化的KNabc菌株喪失了Na+(Li+)/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性；而由突變質(zhì)粒D137E、E161N、D166E、D224A以及D224E轉(zhuǎn)化的KNabc菌株，其Na+(Li+)/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性降低，對應(yīng)于Na+和Li+的Km值分別增加5-9倍和2-l0倍，D166E的活性還向堿端偏移，說明這些殘基與陽離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)移有關(guān)；E229K的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性正常，而Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性