嗜熱菌幾丁質(zhì)結(jié)合域及其在酶固定化中應(yīng)用的研究.pdf

1、生物親和純化固定化技術(shù)可以使目的蛋白的純化與固定化一步完成,具有固定條件溫和、固定化率高等優(yōu)點(diǎn),利用該技術(shù)開(kāi)發(fā)固定化酶的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。幾丁質(zhì)結(jié)合域(ChBD)因其分子量小、對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)影響小、與載體親和力高且其載體幾丁質(zhì)廉價(jià)無(wú)毒而有很大的應(yīng)用價(jià)值。
　　 本研究通過(guò)基因合成的方法獲得了來(lái)自于嗜熱解糖厭氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571)的幾丁質(zhì)結(jié)

2、合域Tt-ChBD,它與嗜溫菌Bacillus circulans WL12幾丁質(zhì)結(jié)合域(Bc-ChBD)有72％的氨基酸同源性。將Tt-ChBD與雙活性酶XAR融合獲得融合酶XAR-L-Tt-ChBD(XC),按照相同方法獲得融合酶XAR-L-Bc-ChBD(XBC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Tt-ChBD對(duì)膠狀、溶脹幾丁質(zhì)具有很強(qiáng)的吸附專一性。當(dāng)給酶量在1～6 nmol范圍時(shí),Tt-ChBD與膠狀幾丁質(zhì)的結(jié)合率在70％以上,與Bc-ChBD相似

3、,當(dāng)給酶量為12 nmol時(shí),Tt-ChBD結(jié)合量、結(jié)合率分別為6.6 nmol和55％,略高于Bc-ChBD。在較高溫度下(75℃)Tt-ChBD比Bc-ChBD具有較好的幾丁質(zhì)結(jié)合能力,結(jié)合率分別為74％、53.8％。Tt-ChBD和Bc-ChBD的最適結(jié)合pH均為4.0,在pH3.0、9.0和10.0時(shí),Tt-ChBD比Bc-ChBD的結(jié)合率較高。在0～3 mol/LNaCl濃度范圍內(nèi),Tt-ChBD與膠狀幾丁質(zhì)的結(jié)合率高于Bc-

4、ChBD,高離子濃度有利于ChBD與幾丁質(zhì)的結(jié)合。
　　 用固定化融合酶XAR-L-Tt-ChBD分批水解低聚木糖,前5次的木糖產(chǎn)率達(dá)80％以上,連續(xù)催化30批次時(shí)產(chǎn)率為60％。利用基因重組技術(shù)將Tt-ChBD分別與Tm-BglA、Te-BglA融合,獲得融合酶Tm-BglA-Tt-ChBD和Te-BglA-Tt-ChBD。使用固定化Tm-BglA-Tt-ChBD水解5％乳糖溶液,連續(xù)操作20次后乳糖轉(zhuǎn)化率均大于90％。使用固定

5、化Te-BglA-Tt-ChBD作用于30％乳糖制備乳寡糖(GOS),乳寡糖的產(chǎn)量約占總糖的30％,成分包括大量的三糖和少量的四糖,連續(xù)操作10次后乳寡糖的產(chǎn)量幾乎不變。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),以上三種固定化融合酶的純度都較高。上述結(jié)果表明Tt-ChBD與幾丁質(zhì)載體結(jié)合牢固,穩(wěn)定性好,有利于在生產(chǎn)中應(yīng)用。
　　 通過(guò)改變Tt-ChBD的融合位置構(gòu)建并表達(dá)兩種融合酶Tt-ChBD-L-XAR-L-XynA(CXX)和XAR-L-X

6、ynA-L-Tt-ChBD(XXC)。在相同表達(dá)條件下,XXC的蛋白表達(dá)量高于CXX。在給酶量0.3～1.8 U范圍內(nèi)CXX與膠狀幾丁質(zhì)的結(jié)合率高于XXC。游離、固定化融合酶CXX和XXC與XAR-L-XynA有著相似的最適溫度和pH。其中固定化CXX和XXC在85℃時(shí)熱穩(wěn)定性比游離酶高,在pH4.2～8.2范圍內(nèi)穩(wěn)定性也高于游離酶。用固定化XXC連續(xù)水解木聚糖,第1批次木糖產(chǎn)量為2.23 mg/mL,連續(xù)催化19批次后木糖產(chǎn)率仍有50