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文檔簡介
1、昆蟲病原真菌是自然界控制昆蟲種群數(shù)量的重要因素之一,具有直接穿透昆蟲體壁而使其致病的獨(dú)特機(jī)制。在穿透昆蟲體壁的過程中,真菌會(huì)分泌一系列的水解酶,如幾丁質(zhì)酶和蛋白酶,降解寄主體壁,幫助菌絲穿透。結(jié)構(gòu)分析表明,大多數(shù)幾丁質(zhì)酶具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域,包括催化域、鉸鏈區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合域。幾丁質(zhì)結(jié)合域能幫助幾丁質(zhì)酶結(jié)合到幾丁質(zhì)底物上,提高局部區(qū)域的酶濃度,從而促進(jìn)對底物的降解。然而目前發(fā)現(xiàn)的來自昆蟲病原真菌的幾丁質(zhì)酶缺乏幾丁質(zhì)結(jié)合域。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明
2、,在不具有幾丁質(zhì)結(jié)合域的昆蟲病原真菌幾丁質(zhì)酶Bbchitl上添加家蠶幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合域,可以提高幾丁質(zhì)酶Bbchitl對不溶性底物的結(jié)合及降解能力。在球孢白僵菌中超量表達(dá)該融合蛋白,菌株的毒力得到顯著提高。但是添加更多的幾丁質(zhì)結(jié)合域是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)幾丁質(zhì)酶與底物的結(jié)合能力,促進(jìn)對底物的降解,從而進(jìn)一步提高菌株的毒力呢?基于此設(shè)想,本文在前期工作的基礎(chǔ)上構(gòu)建了具有多個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶,并進(jìn)行了表達(dá)及特性分析。 獲得
3、的主要結(jié)果如下: 1.雜交幾丁質(zhì)酶畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建在具有一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶Bbchitl-BmChBD(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)基礎(chǔ)上,構(gòu)建了具有兩個(gè)和三個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶的酵母表達(dá)載體pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。 2.雜交幾丁質(zhì)酶的酵母表達(dá)及特性分析在畢赤酵母中表達(dá)并純化了帶有1、2和3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域的雜交幾丁質(zhì)酶Bb
4、chitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>、Bbchitl-(BmChBD)<,3>和野生型幾丁質(zhì)酶Bbchitl。結(jié)合分析和酶學(xué)特性分析結(jié)果表明:1)在酶濃度為80μg/mL時(shí),幾丁質(zhì)結(jié)合域的個(gè)數(shù)和雜交幾丁質(zhì)酶與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合存在劑量效應(yīng),即隨著幾丁質(zhì)結(jié)合域數(shù)量的增加,雜交幾丁質(zhì)酶與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合能力增強(qiáng)。雜交幾丁質(zhì)酶Bbchitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(
5、BmChBD)<,3>與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合率分別為 64.4%、67.4%和86.8%,明顯高于野生型幾丁質(zhì)酶(4.3%)。而酶濃度為40μg/mL 時(shí),雜交幾丁質(zhì)酶與粉末幾丁質(zhì)的結(jié)合無明顯差異。2)添加幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)锥≠|(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH無明顯影響,野生型和雜交幾丁質(zhì)酶均在pH5.0和55℃的條件下具有最高的幾丁質(zhì)酶活性。雖然添加幾丁質(zhì)結(jié)合域提高了幾丁質(zhì)酶降解不溶性底物的能力,卻降低了雜交酶的熱穩(wěn)定性。 3.雜交幾丁質(zhì)酶球
6、孢白僵菌表達(dá)載體的構(gòu)建為了進(jìn)一步分析幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)η蜴甙捉┚玖Φ挠绊?,?gòu)建了Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(BmChBD)<,3>的球孢白僵菌表達(dá)載體 puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。在下一步工作中,將進(jìn)行相應(yīng)的生測試驗(yàn)。 本論文研究表明添加2個(gè)和3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域BmChBD可以增加雜交幾丁質(zhì)酶對
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