幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的選育.pdf

1、幾丁質(zhì)(chitin)又稱甲殼素,是由N-乙酰-D-葡糖胺單體通過β-1,4糖苷鍵連接而成的直鏈高分子化合物。甲殼質(zhì)是自然界中最豐富的天然有機(jī)化合物之一,其數(shù)量僅次于纖維素。殼聚糖(脫乙酰甲殼素,chitosan),化學(xué)名1,4-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖,又稱脫乙酰幾丁質(zhì)、甲殼胺、可溶性幾丁質(zhì)等,是甲殼素的一類最重要的衍生物,結(jié)構(gòu)類似于纖維素,是甲殼質(zhì)的脫乙酰形式,也是生物界中普遍存在的唯一的堿性多糖;殼聚糖在食品、化妝品、紡

2、織、醫(yī)療、印染、保健、廢水處理等許多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值,存在著巨大的的市場推廣和產(chǎn)品開發(fā)潛力。
　　 甲殼質(zhì)脫乙酰酶(Chitin Deacetylase,CDA)是能夠催化甲殼素脫乙酰過程,促使甲殼素向殼聚糖轉(zhuǎn)化的酶;在甲殼素脫乙酰酶的作用下得到的殼聚糖脫乙酰度高、脫乙酰度均一,如將甲殼素預(yù)先處理后使用CDA催化,得到的殼聚糖脫乙酰度可高達(dá)97%;CDA催化甲殼素脫乙酰的反應(yīng)條件易控制,專一性強(qiáng),污染小,是許多國內(nèi)外研究的

3、焦點;但是現(xiàn)階段對甲殼素脫乙酰酶的應(yīng)用程度還不高,產(chǎn)酶菌株只有少數(shù)霉菌。
　　 本工作通過采集多份土壤樣本,初篩、復(fù)篩分離得到一株產(chǎn)甲殼質(zhì)脫乙酰酶能力較強(qiáng)的放線菌,對該菌株進(jìn)行了鑒定,并對其發(fā)酵條件和產(chǎn)生的脫乙酰酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,為分離篩選出幾丁質(zhì)脫乙酰酶高產(chǎn)菌株、為生物制備殼聚糖提供來源,并為進(jìn)一步提高該菌株產(chǎn)酶能力及酶的活性提供研究基礎(chǔ)。
　　 實驗簡介如下:
　　 (1)通過二級篩選從采集的土壤樣品中

4、分離出一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶能力較強(qiáng)、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的菌株,并命名為F2-7-3;通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗、16SrDNA測序分析等方法對該菌株進(jìn)行了鑒定,并對其發(fā)酵條件、發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵產(chǎn)生的脫乙酰酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。經(jīng)初步鑒定該菌株屬于放線菌門(Actinobacteria),放線菌綱(Actinobacteria),放線菌亞綱(Actinobacteridae),放線菌目(Actinomycetales),棒桿菌亞目(Co

5、rynebacterineae),諾卡氏菌科(Nocardiaceae),紅球菌屬(Rhodococcus)。
　　 (2)利用單因素結(jié)合響應(yīng)面法研究了菌株F2-7-3的發(fā)酵培養(yǎng)基成分,并優(yōu)化了培養(yǎng)條件,根據(jù)初步研究結(jié)果,菌株F2-7-3產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度度30℃左右、pH7、種齡15～24h、裝液量為10%;選擇出的影響甲殼素脫乙酸酶產(chǎn)量的培養(yǎng)基成分關(guān)鍵因子為:蔗糖、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂,并利用B

6、ox-Behnken試驗擬合得到了響應(yīng)曲面函數(shù),最終可得到最佳培養(yǎng)基組合為為:蔗糖添加量:7g/L;酵母膏添加量:9.15g/L;磷酸二氫鉀添加量:0.93mmol/L;此條件下酶活水平達(dá)到260.26/mL。
　　 (3)通過對菌株F2-7-3所產(chǎn)的甲殼素脫乙酰酶的基本酶學(xué)性質(zhì)研究表明:該酶在中性偏堿性環(huán)境下酶活力較高,最適pH為7.0、最適反應(yīng)溫度為50℃,Mg2+、Zn2+、Fe2+、Co2+對酶促反應(yīng)有抑制作用,并隨濃度