過敏蛋白TBt的特性及其與VB1的相互作用.pdf

1、蕎麥作為一種藥食同源性作物，越來越受到人們的廣泛關(guān)注。蕎麥蛋白質(zhì)有較為均衡的氨基酸組成。蕎麥種子中包含有很多的藥用成分，如，黃酮、類黃酮、植物甾醇、蕎麥堿、硫胺素結(jié)合蛋白等，這些成分對(duì)于一些慢性疾病，如，糖尿病、高血壓、高血脂和其他心、腦血管類的疾病有很好的預(yù)防和治療作用。同時(shí)蕎麥種子蛋白可以引起過敏反應(yīng)，也極大地限制了蕎麥的利用。近年來，日本，韓國的一些科學(xué)家對(duì)甜蕎中的過敏成分進(jìn)行了研究，分離得到了60-70 kDa，34-36 kD

2、a,22 kDa，19 kDa，16 kDa，9 kDa等分子量不等的過敏蛋白，但對(duì)苦蕎過敏成分的研究相對(duì)較少。我們之前以壽陽苦蕎為原料，經(jīng)分離純化得到了一種分子量為24 kDa的過敏蛋白，通過免疫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其為苦蕎中主要過敏蛋白，并且采用基因克隆技術(shù)獲得24 kDa過敏蛋白基因。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步獲得一種56 kDa蛋白的基因，并在Genebank登錄。
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)種子中蛋白質(zhì)的溶解性差異，采用緩沖液抽提，鹽析，離子交換和凝膠

3、柱純化等步驟，得到了一種苦蕎主要過敏蛋白，命名為TBt。運(yùn)用分子排阻層析，Native-PAGE和SDS-PAGE對(duì)TBt的分子量及聚合狀態(tài)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)TBt在天然條件下以三聚體的形式存在，每個(gè)單體又由二硫鍵連接的兩個(gè)分子量為24 kDa和34 kDa的亞基組成。運(yùn)用DTNB試劑測(cè)定了TBt中的巰基含量，TBt中游離巰基的含量為1.95 mol/g，總巰基含量為37.91 mol/g。表明在TBt中，絕大部分的半胱氨酸以二硫鍵的形式

4、存在，而游離的巰基含量很少。通過計(jì)算確定每個(gè)TBt中有一對(duì)二硫鍵，而且主要為鏈間的二硫鍵。將純化得到的TBt用β-巰基乙醇和碘乙酰胺處理后，得到了TBa和TBb兩個(gè)片段。采用ELISA方法分別對(duì)TBt，TBa，TBb的免疫活性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)TBa和TBb的免疫活性高于TBt，這可能與TBt蛋白中的表位被相互覆蓋等因素有關(guān)。
　　蕎麥過敏蛋白屬于球蛋白類，是蕎麥種子中較為豐富的一類儲(chǔ)藏蛋白。本文通過熒光光譜技術(shù)，研究了VB1與苦蕎

5、麥過敏蛋白TBt的相互作用。發(fā)現(xiàn)VB1和TBt可形成復(fù)合物，兩者結(jié)合后其結(jié)合常數(shù)k=2.42×105 L/mol,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為2。運(yùn)用計(jì)算出的熱力學(xué)函數(shù)，初步確定他們之間的作用力主要為靜電作用力;通過Native-PAGE分析顯示，VB1與TBt作用的位點(diǎn)可能為TBt分子中的羧基。
　　為了開發(fā)出一種簡單、適用的蕎麥?zhǔn)澄镞^敏檢測(cè)試劑，用于臨床檢測(cè)，我們將上述制備獲得的TBt作為包被抗原，初步制備出蕎麥過敏檢測(cè)試劑盒。確定了用EL