家蠶類核質(zhì)蛋白基因的研究.pdf

1、核質(zhì)蛋白(nucleoplasmin)是高等真核生物卵母細(xì)胞和卵細(xì)胞核中重要的分子伴侶，體外實(shí)驗(yàn)證明核質(zhì)蛋白在核小體的裝配、精子染色質(zhì)重建以及細(xì)胞凋亡的染色質(zhì)聚縮過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。在對(duì)家蠶蛹期cDNA文庫(kù)測(cè)序中，我們獲得一條cDNA序列長(zhǎng)度為1183 bp，其編碼的氨基酸序列與已知的核質(zhì)蛋白序列共有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。該保守結(jié)構(gòu)域有約100個(gè)氨基酸殘基，同源性達(dá)61.1﹪。我們將它命名為家蠶類核質(zhì)蛋白 BmNLP(nucleopl

2、asmin-like protein fromBombyx mori)，Genbank登錄號(hào)為EF210318。該基因的開放閱讀框全長(zhǎng)486 bp，編碼的蛋白有161個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為18.2 kDa，等電點(diǎn)為4.33。將其ORF克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定及序列測(cè)定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，該基因得以成功表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白以可溶形式存在，經(jīng)過鎳柱親和層析純化后，以純

3、化的重組蛋白為抗原免疫兔獲得該蛋白的多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)，抗體效價(jià)可達(dá)1∶25600以上。ELISA和Western blot檢測(cè)蠶蛹蛋白，反應(yīng)都呈陽性，進(jìn)一步證實(shí)了BmNLP的存在。利用該抗體以 Western blot檢測(cè)家蠶三個(gè)發(fā)育階段和五齡幼蟲四種組織或器官中BmNLP蛋白的表達(dá)和分布，發(fā)現(xiàn)在卵、五齡幼蟲、蛹三個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，表達(dá)量比較接近；各個(gè)組織或器官中，在頭部表達(dá)最少，其次是中腸，而絲腺中表達(dá)最多。利用抗體的免

4、疫熒光標(biāo)記對(duì)家蠶Bm5細(xì)胞定位，觀察到熒光集中分布在細(xì)胞內(nèi)一個(gè)近似圓形的區(qū)域，以DAPI復(fù)染后確定為細(xì)胞核，從而證實(shí) BmNLP定位在細(xì)胞核中；利用激光斷層掃描發(fā)現(xiàn)間期細(xì)胞中BmNLP分布更靠近核膜，而分裂細(xì)胞中整個(gè)核都有分布。此外，以該基因的ORF為模板體外轉(zhuǎn)錄dsRNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 Bm5細(xì)胞，48 h后以MTT法檢測(cè)干擾前后細(xì)胞活力，同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白作ELISA檢測(cè)，RNA干擾后的細(xì)胞活力下降，總蛋白中目