人內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)脂多糖相關(guān)因子1（EOLA1）的啟動子克隆及初步鑒定.pdf

1、人類基因組計(jì)劃完成后，絕大多數(shù)基因得到了定位。深入研究這些基因的功能，闡明其在生命活動中的意義成為后基因組時(shí)代的主要任務(wù)。迄今為止，大部分基因功能得到了較深的認(rèn)識，但還有部分基因的功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍不清楚，這其中包括內(nèi)皮高表達(dá)脂多糖相關(guān)因子1(EOLA1)基因。 EOLA1基因是我們實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中應(yīng)用抑制消減雜交(SSH)和cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)(RACE)，從脂多糖(LPs)刺激后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中克隆到一個人類新

2、基因全長cDNA序列，經(jīng)Northernblot驗(yàn)證后作為人類新基因被GenBank全長序列庫所接受(NoAY074889)。因其在受LPS刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，故命名為內(nèi)皮高表達(dá)脂多糖相關(guān)因子1(endothelial-overexpressedlipopolysaccharide-associatedfactor1，EOLA1)。對該基因的特性已完成的研究顯示其轉(zhuǎn)錄序列全長為1404個bp，定位于染色體Xq27.4，編碼蛋白由1

3、58個氨基酸組成，分子量17.89kDa，等電點(diǎn)6.43，親水性好，為可溶性蛋白。其二級結(jié)構(gòu)含α螺旋、β片層結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角，并形成一個螺旋一轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)基序。EOLA1氨基酸序列包含N-糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和酪氨酸激酶2磷酸化位點(diǎn)。 多組織Northernblot顯示EOLA1基因除在LPS刺激的內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)表達(dá)外，在正常成人心臟、骨胳肌、腎臟、肝臟和胎盤有較強(qiáng)的表達(dá)，在脾臟、結(jié)腸和小腸表達(dá)較弱，而在腦、胸腺

4、、肺和外周白細(xì)胞則未見表達(dá)。在7種癌細(xì)胞株上，顯示在早幼粒白血病系HL-60、海拉細(xì)胞系S3、慢性白血病K-562細(xì)胞系都有表達(dá)，以在白血病細(xì)胞系MOLT-4和腺癌細(xì)胞系SW480表達(dá)為最高，但在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和黑素瘤細(xì)胞系G-361無表達(dá)。在經(jīng)過G418壓力篩選后的穩(wěn)定表達(dá)EGFP-EOLA1(enhancedgreenfluorescentprotein-EOLA1)融合蛋白的ECV304細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)EOLA1蛋白為全細(xì)胞分布。

5、酵母雙雜交顯示EOLA1蛋白與細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白相互作用，調(diào)控細(xì)胞增殖，參與炎癥反應(yīng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)保護(hù)機(jī)制。但確切的EOLA1基因功能和其調(diào)控機(jī)制仍不清楚。 為幫助明確基因的功能，了解基因在不同組織和細(xì)胞中差異表達(dá)的原因，闡明其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制是必不可少的步驟?；蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控主要由啟動子、增強(qiáng)子和沉默子、順式作用元件和與其相互結(jié)合的反式作用因子構(gòu)成。其中，啟動子提供了基本的轉(zhuǎn)錄活性，多數(shù)基因啟動子具有典型的TATA盒結(jié)構(gòu)，而不具有TATA盒

6、的啟動子基因，常有多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。有研究顯示EOLA1基因mRNA轉(zhuǎn)錄本存在兩種不同的剪切形式，其原因可能與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不同相關(guān)。另外，轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合既可能增強(qiáng)啟動子的活性促使轉(zhuǎn)錄，也可能抑制啟動子的活性阻滯轉(zhuǎn)錄，從而使目的基因在不同細(xì)胞或同一細(xì)胞不同狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄的差異。為此，本研究首先克隆EOLA1基因5’-側(cè)翼區(qū)約2.4kb的基因組DNA序列，再缺失突變?yōu)閮蓚€不同長度的片段，分別插入雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)

7、染細(xì)胞后，瞬時(shí)表達(dá)，通過檢測報(bào)告基因活性的變化來反映5’-側(cè)翼區(qū)內(nèi)啟動子區(qū)域，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測其啟動子并與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對照，為全面闡明EOLA1表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供基本數(shù)據(jù)。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，從該細(xì)胞中抽提基因組DNA，并以該基因組DNA作模板采用PCR方法擴(kuò)增到EOLA1基因上游3個不同長度的基因片段，然后應(yīng)用pGL3-Basic空質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH

8、5a，篩選陽性克隆，構(gòu)建得到不同長度片段啟動子-熒光素酶載體：pGL3-Basic-1076bp、pGL3-Basic-1723bp、pGL3-Basic-2426bp。并經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，測序證明克隆基因片段插入方向正確，插入的接頭處核苷酸序列正常，未發(fā)現(xiàn)堿基突變。因此pGL3-Basic-EOLA1系列重組體構(gòu)建成功。 將上面構(gòu)建所得的重組質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染ECV-304細(xì)胞，檢測報(bào)告基因相對熒光活性

9、結(jié)果顯示，與pGL3-Basic空載體相比，3種構(gòu)建的質(zhì)粒(pGL3-Basic-1076bp、pGL3-Basic-1723bp、pGL3-Basic-2426bp)熒光活性均明顯增強(qiáng)(p＜0.01或p＜0.05)，提示相應(yīng)的基因序列均具有啟動報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的能力。其中pGL3-Basic-1723bp的轉(zhuǎn)錄活性最高。 利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測啟動子所在區(qū)域結(jié)果顯示：在EOLA1基因5’側(cè)翼區(qū)-671～-721區(qū)存在啟動子的預(yù)測