運(yùn)用反義核酸及TF decoy技術(shù)針對豬內(nèi)皮細(xì)胞α1，3GT基因啟動子B的研究.pdf

1、第一部分 Oligofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子SP1 反義及誘騙性寡核苷酸轉(zhuǎn)染豬內(nèi)皮細(xì)胞系條件的優(yōu)化研究
　　 目的：研究擬探索確定高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄因子SP1 反義及誘騙性寡核苷酸(AS-ODN 及decoy ODNs)在oligofectamine介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系(SV-40-PED)的最佳轉(zhuǎn)染條件和效果，為以轉(zhuǎn)錄因子為靶點的基因治療在抑制異種排斥反應(yīng)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：針對豬α 1,3GT基

2、因上游調(diào)控序列中4個特異啟動子中的啟動子B，設(shè)計并生物合成數(shù)條寡核苷酸分子(AS-ODN、decoy ODNs 及錯配ODNs)，運(yùn)用oligofectamine轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)染永生化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED。分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀和顯微熒光技術(shù)，同時測定細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)的含量評價各組PEC的攝取情況以及寡核苷酸分子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對PEC 生長的影響情況。
　　 結(jié)果：SV-40-PED在oligofectamine的介導(dǎo)

3、下可以攝取SP1 AS-ODN 及SP1 decoyODNs。在6 孔培養(yǎng)板中，當(dāng)SP1 decoy ODNs 終濃度為250nM、轉(zhuǎn)染26 h 時，轉(zhuǎn)染效率最佳，其攝取率為(93.37±0.85[％])，熒光強(qiáng)度為(200.30±12.22)；同時細(xì)胞毒性相對較低(乳酸脫氫酶含量為(49.61±17.13)U/L)；此時細(xì)胞內(nèi)熒光物質(zhì)主要聚集于細(xì)胞核。而錯配組與陰性對照組相比未見明顯不同。
　　 結(jié)論：Oligofectami

4、ne 轉(zhuǎn)染體系是一種高效、低毒的寡核苷酸轉(zhuǎn)染方式。SP1 ODNs終濃度為250 nM、轉(zhuǎn)染26 h 時可以為豬內(nèi)皮細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染提供良好效果。本研究為以轉(zhuǎn)錄因子為靶點的基因治療在抑制異種排斥反應(yīng)中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 第二部分轉(zhuǎn)錄因子SP1 反義及誘騙性寡核苷酸對豬內(nèi)皮細(xì)胞α半乳糖苷鏈表達(dá)的影響
　　 目的：本研究旨在進(jìn)一步評價SP1 AS-ODN 及SP1 decoy ODNs 對豬內(nèi)皮細(xì)胞α 1,3-GT基因

5、及α-Gal蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：SP1 反義(SP1 AS-ODN)及誘騙性寡核苷酸(SP1 decoy ODNs)轉(zhuǎn)染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系，細(xì)胞爬片后熒光顯微鏡下觀察α半乳糖糖鏈(α Gal)抗原表位的表達(dá)；蛋白印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)情況；流式細(xì)胞學(xué)檢測轉(zhuǎn)染后豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系膜蛋白α Gal的表達(dá)；RT-PCR 法檢測SV-40-PED 轉(zhuǎn)染前后α 1,3 半乳糖轉(zhuǎn)移酶(α 1,3GT)m RNA

6、。
　　 結(jié)果：熒光顯微鏡下細(xì)胞爬片可見轉(zhuǎn)染組(SP1 decoy ODNs組)細(xì)胞膜熒光表達(dá)明顯減弱,部分部位可見點狀熒光缺損。Western blot 顯示decoy ODNs /PED的α Gal的相對吸光度值為(48.2±0.9)，僅為空轉(zhuǎn)染組(只含有轉(zhuǎn)染試劑oligofectamine)(91.6±1.7)的52.6[％](P<0 .05)。轉(zhuǎn)染組α 1,3GT基因異構(gòu)體的mRNA 表達(dá)量(異構(gòu)體1，0.42±0.20

7、 ；異構(gòu)體2，0.27±0.12)顯著低于空轉(zhuǎn)染組(異構(gòu)體1，0.72±0.17 ；異構(gòu)體2，0.50±0.19 ；p均＜0.05),但錯配組(錯義decoy ODNs組)及空轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：SP1 decoy ODNs 可以靶向性抑制豬內(nèi)皮細(xì)胞系α Gal基因的表達(dá)，為抑制超急性排斥反應(yīng)的研究提供了新的思路和策略。
　　 第三部分轉(zhuǎn)染后豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系與抗人血清補(bǔ)體細(xì)胞毒作用的

8、實驗研究
　　 目的：本研究旨在成功建立對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED 靶向轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，擬用豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系和人血清建立超急性排斥反應(yīng)(HAR)體外模型，探討TF decoy技術(shù)處理后的豬內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合抗體/補(bǔ)體能力的變化以及是否具有抗人血清補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。
　　 方法：在抗體/補(bǔ)體與SV-40-PED 結(jié)合實驗中，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測decoy ODNs 轉(zhuǎn)染處理SV-40-PED 后結(jié)合抗體/補(bǔ)體能力的變化

9、，并通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗評價TF decoy 技術(shù)對人血清細(xì)胞毒效應(yīng)的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞學(xué)檢測中，decoy ODNs組與空轉(zhuǎn)染組相比，無論抗體還是補(bǔ)體結(jié)合水平均有不同程度的下降，抗體/補(bǔ)體下降程度依次為IgM 68.0[％]，IgG 56.1[％]，C3c55.1[％](P<0.05)。20[％]正常人血清(normal human serum，NHS)及40[％]NHS 對空轉(zhuǎn)染組和錯配組SV-40

10、-PED 均有不同程度的殺傷能力，而decoy ODNs 轉(zhuǎn)染SV-40-PED 后即可呈現(xiàn)出對此效應(yīng)的保護(hù)作用，與空轉(zhuǎn)染組相比，20[％]NHS組和40[％]NHS組其靶細(xì)胞溶解率分別下降15.0[％]和30.2[％] (P<0.05)，表現(xiàn)為補(bǔ)體對SV-40-PED的殺傷率不同程度的下降?？辙D(zhuǎn)染組和錯配組間殺傷率無明顯差異(P>0.05)，熱滅活正常人血清(heat-inactivated NHS，HINHS)作為陰性對照對各組SV

11、-40-PED 均表現(xiàn)出背景毒性作用。
　　 結(jié)論：在體外補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)中，decoy ODNs 轉(zhuǎn)染豬內(nèi)皮細(xì)胞SV-40-PED可以呈現(xiàn)出其保護(hù)作用。
　　 第四部分轉(zhuǎn)染后豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系與人外周血單個核細(xì)胞之間的作用研究
　　 目的：建立人外周血單個核細(xì)胞和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)研究模型,在體外模擬異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞與人血清相互作用的過程，探討decoy ODNs在人PBMC 對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞單向混合培

12、養(yǎng)實驗中的影響。
　　 方法：SV-40-PED 轉(zhuǎn)染后分別運(yùn)用氚3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法和MTT 法檢測人外周血單個核細(xì)胞和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型中人PBMC的增殖情況，探討人外周血單個核細(xì)胞與轉(zhuǎn)染前后豬內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的變化。
　　 結(jié)果：未加入刺激細(xì)胞的人外周血單個核細(xì)胞增生微弱，加入經(jīng)絲裂霉素C處理的異種刺激細(xì)胞SV-40-PED 后，各組人外周血單個核細(xì)胞均分裂增生，并在5～7d左右逐漸達(dá)到最大。在

13、共培養(yǎng)第5天，3H-TdR 法檢測顯示decoy ODNs 轉(zhuǎn)染組的cpm 值的下降程度為空轉(zhuǎn)染組的67.1[％]，空轉(zhuǎn)染組和錯配組的組間比較無明顯差異(P＜0.05)。
　　 Decoy ODNs 轉(zhuǎn)染處理SV-40-PED 后第5天，MTT 法顯示人PBMC的增殖能力僅為空轉(zhuǎn)染組的39.2[％] (P<0.05)，呈現(xiàn)出對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：在人外周血單個核細(xì)胞和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)研究模型中，