慢病毒介導(dǎo)RNA干擾α1,干擾α1,3GT、NF-κB控制異種心臟移植排斥反應(yīng)研究.pdf

1、本研究構(gòu)建了針對(duì)小鼠α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α1，3 galactosyltransferase，α1，3GT)和核轉(zhuǎn)錄因-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)RelA亞基基因的短發(fā)夾狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)慢病毒載體，通過體外轉(zhuǎn)染小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(EOMA)的方法，研究RNA干擾α1，3GT和RelA基因表達(dá)的效果，并篩選針對(duì)每種基因相對(duì)高效的shRNA慢病毒；通過經(jīng)陰莖

2、背靜脈注射慢病毒載體的方法體內(nèi)轉(zhuǎn)染小鼠心臟，研究慢病毒載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率及對(duì)靶基因的體內(nèi)抑制效果；并以獲得的α1，3GT和RelA表達(dá)減低的小鼠心臟為供體，建立穩(wěn)定的小鼠-大鼠異種異位心臟移植模型，研究慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾α1，3GT和RelA在小鼠-大鼠異種心臟移植模型中控制異種移植排斥反應(yīng)的作用并探討其機(jī)制。
　　 第一部分、α1，3GT和RelA shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：構(gòu)建針對(duì)小鼠

3、α1，3GT和RelA基因的shRNA慢病毒載體，探討shmYA慢病毒載體的體外轉(zhuǎn)染效率及對(duì)α1，3GT和RelA基因的抑制效果，并篩選相對(duì)高效的shRNA慢病毒載體。
　　 方法：針對(duì)α1，3GT和RelA mRNA分別設(shè)計(jì)合成三條特異性shRNA，并分別構(gòu)建并合成高滴度的攜帶α1，3GT和RelA shmNA質(zhì)粒的重組慢病毒載體，設(shè)置空白對(duì)照組，陰性病毒對(duì)照組、三個(gè)α1，3GT-shRNA慢病毒干預(yù)組和三個(gè)RelA-shRN

4、A慢病毒干預(yù)組，分別轉(zhuǎn)染EOMA并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件；以熒光實(shí)時(shí)定時(shí)PCR和免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后EOMA中α1，3GT和RelA及Galα1，3Gal抗原的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：針對(duì)α1，3GT和RelA的shRNA質(zhì)粒構(gòu)建成功，并得到了高滴度攜帶α1，3GT和RelA shRNA質(zhì)粒的重組慢病毒載體并可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EOMA；與對(duì)照組相比α1，3GT和RelA shRNA慢病毒干預(yù)組EOMA的α1，3GT和RelA mRNA轉(zhuǎn)錄水平均

5、顯著降低(p<0.01)，α1，3GT-shRNA慢病毒干預(yù)組EOMA的Galα1，3Gal抗原水平較對(duì)照組顯著降低(p<0.01)；其中α1，3GTi-3和RelAi-3 shRNA慢病毒干預(yù)組對(duì)目的基因的表達(dá)抑制最為明顯。
　　 結(jié)論：應(yīng)用成功構(gòu)建的α1，3GT和RelA shRNA慢病毒載體可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EOMA，并可顯著抑制α1，3GT、RelA基因及Galα1，3Gal抗原的表達(dá)，α1，3GTi-3和RelAi-3sh

6、KNA慢病毒為相對(duì)高效病毒，可進(jìn)一步用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分、經(jīng)陰莖背靜脈注射慢病毒載體的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 目的：評(píng)價(jià)經(jīng)陰莖背靜脈注射shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠心臟的轉(zhuǎn)染效果，探討慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾α1，3GT和RelA的體內(nèi)抑制效果。
　　 方法：設(shè)(1)生理鹽水對(duì)照組、(2)陰性慢病毒組、(3)α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組、(4)RelAi-3-shRNA慢病毒組和(5)雙病

7、毒組，經(jīng)陰莖背靜脈注射干預(yù)小鼠心臟，于注射140h后取小鼠心臟及肝、脾組織，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察組織冰凍切片EGFP綠色熒光的方法評(píng)價(jià)心臟轉(zhuǎn)染效果及慢病毒載體在體內(nèi)各臟器的分布情況；分別以實(shí)時(shí)定量熒光PCR、免疫熒光染色法和Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后α1，3GT和RelAmRNA、Galα1，3Gal抗原和RelA蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：慢病毒干預(yù)組小鼠心臟綠色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于鹽水對(duì)照組，尤以心肌血管內(nèi)皮為強(qiáng)；肝、脾組織

8、亦有少量綠色熒光分布，但遠(yuǎn)較心臟組織為弱；shRNA慢病毒干預(yù)組目的基因mRNA表達(dá)水平比對(duì)照組明顯降低(p<0.01)，但單一病毒干預(yù)組與雙病毒干預(yù)組間比較，目的基因的mRNA表達(dá)水平無顯著性差異(p>0.05)；α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組心臟血管內(nèi)皮Galα1，3Gal抗原表達(dá)水平比對(duì)照組明顯降低；(4)、(5)組RelA蛋白表達(dá)水平與對(duì)照比較明顯降低(p<0.01)，但(4)、(5)組間比較無顯著性差異(p>0.05)

9、。
　　 結(jié)論：于體內(nèi)經(jīng)陰莖背靜脈注射的方法可使慢病毒載體在小鼠心臟獲得高效轉(zhuǎn)染；應(yīng)用成功構(gòu)建的shRNA慢病毒載體可在體內(nèi)有效抑制α1，3GT和RelA基因表達(dá)，并可有效降低Galα1，3Gal抗原和RelA蛋白的表達(dá)水平，可進(jìn)一步應(yīng)用于活體移植實(shí)驗(yàn)。
　　 第三部分、RNA干擾α1，3GT、RelA在異種心臟移植模型中的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：觀察經(jīng)陰莖背靜脈注射shRNA慢病毒干預(yù)小鼠-大鼠異種異位心臟移植模

10、型中排斥反應(yīng)的影響，探討其抗排斥反應(yīng)的機(jī)制。
　　 方法：建立小鼠-大鼠異種異位心臟移植模型；以經(jīng)陰莖背靜脈注射shRNA慢病毒干預(yù)Balb/c小鼠心臟，140h后以之為供體，移植至F344大鼠頸部，共設(shè)(1)生理鹽水對(duì)照組、(2)陰性慢病毒組、(3)α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組、(4)RelAi-3-shRNA慢病毒組和(5)雙病毒組，每組各8只；觀察移植心臟存活情況；待供心停跳后，取供心標(biāo)本，分別以實(shí)時(shí)定量熒光PC

11、R、免疫熒光染色法和Westernblot檢測(cè)供心α1，3GT和RelAmRNA、Galα1，3Gal抗原和RelA蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：α1，3GTi-3-shRNA慢病毒組和雙病毒組供心存活時(shí)間較對(duì)照組和RelAi-3-shRNA慢病毒組為長(zhǎng)，其差異有顯著(p<0.01)，但此兩組間比較，供心存活時(shí)間無顯著性差異(p>0.05)；RelAi-3-shRNA慢病毒組供心存活其與對(duì)照組間無顯著性差異(p>0.05)；各sh

12、RNA慢病毒干預(yù)組供心排斥后目的基因的mRNA水平與排斥前比較，無顯著性差異(p>0.05)；各shRNA慢病毒干預(yù)組相應(yīng)目的基因的蛋白表達(dá)水平在排斥前后亦無顯著性差異(p>0.05)，但對(duì)照組供心排斥后RelA蛋白表達(dá)水平較排斥前明顯升高(p<0.01)；而shRNA病毒干預(yù)組供心排斥后目的基因蛋白表達(dá)水平仍均較對(duì)照組為低，其差異有顯著性(p<0.01)。
　　 結(jié)論：α1，3GTi-3-shRNA慢病毒干預(yù)供體，可以有效降低