NF-κB在角膜移植排斥反應(yīng)及角膜新生血管形成中作用的實驗研究.pdf

1、研究背景 同種異體角膜移植是治療角膜盲最為有效的方法，而角膜移植排斥反應(yīng)仍然是移植失敗的主要原因；角膜新生血管是角膜盲的主要原因，亦是角膜移植排斥反應(yīng)的高危因素。因此，如何防治角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)及新生血管一直是角膜病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前研究表明，角膜移植排斥反應(yīng)是一個T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)參與的復(fù)雜的反應(yīng)過程，受多種因素的調(diào)節(jié)，許多細(xì)胞因子、粘附因子的過度活化參與角膜移植排斥反應(yīng)。NF-κB是一種重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核細(xì)胞

2、胞漿中，它可被多種細(xì)胞外刺激激活，激活后的NF-κB自胞漿進(jìn)入胞核與靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、粘附因子等基因的表達(dá)。 目前研究證實在角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)病與角膜新生血管形成過程中，ICAM-1、VEGF等因子起著重要的啟動和調(diào)控作用，但是，這些因子的來源目前還不完全清楚。而NF-κB又在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控著這些因子的表達(dá)，因此NF-κB可能是角膜移植排斥反應(yīng)與角膜新生血管發(fā)病和病程演變中上游調(diào)節(jié)因子，如果抑制NE-κB對這些因子的轉(zhuǎn)錄

3、，有可能阻斷角膜移植排斥反應(yīng)與角膜新生血管等炎性因子起重要作用的疾病的發(fā)病進(jìn)程。 目的 一、研究NF-κB及其下游因子ICAM-1、VEGF在正常角膜中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制及治療提供新的思路。 二、檢測縫線誘導(dǎo)角膜新生血管術(shù)后不同時間點(diǎn)角膜NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)的動態(tài)變化，以及地塞米松對其表達(dá)的影響，探討NF-κB在角膜新生血管形成中的作用。 三、檢測大鼠角膜

4、移植術(shù)后不同時間點(diǎn)角膜植片NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)的動態(tài)變化，分析NF-κB與角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)系及其與下游因子ICAM-1、VEGF表達(dá)的相關(guān)性。并觀察環(huán)孢霉素A對NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)的影響。 方法 一、正常大鼠角膜NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)及其意義。 健康清潔級Wistar大鼠3只，體重200-250g。10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后立即摘除眼球共5個，剪

5、下完整角膜(帶角膜緣)，置于4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。每份標(biāo)本連續(xù)制作4張4um切片，1張行HE染色，其余3張分別用于NF-κB、ICAM-1、VEGF的免疫組織化學(xué)染色(SABC法)檢測。采用計算機(jī)圖像系統(tǒng)分析攝片，檢測NF-κB與ICAM-1、VEGF在正常大鼠角膜表達(dá)。每張切片角膜中央?yún)^(qū)隨機(jī)取5個200倍視野，計算陽性細(xì)胞率(陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù))，取其平均值作為該標(biāo)本各檢測指標(biāo)的表達(dá)率。 二、NF-

6、κB與ICAM-1、VEGF在大鼠角膜新生血管模型角膜中的動態(tài)表達(dá)及地塞米松的影響。 角膜縫線法建立角膜新生血管大鼠模型50只，隨機(jī)分為兩組：生理鹽水對照組、地塞米松治療組，每組25只。各組術(shù)后不同時間點(diǎn)(1d，3d，7d，12d，18d)隨機(jī)取5只大鼠進(jìn)行角膜新生血管生長評分，并于各時間點(diǎn)取角膜，固定，切片。HE染色光鏡下觀察CNV化角膜病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)染色(SABC法)檢測NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)。每

7、張切片角膜中央?yún)^(qū)隨機(jī)取5個200倍視野，計算陽性細(xì)胞率(陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù))，取其平均值作為該標(biāo)本各檢測指標(biāo)的表達(dá)率。 三、NF-κB與ICAM-1、VEGF在大鼠角膜移植物中的動態(tài)表達(dá)及環(huán)孢霉素A的影響。 建立大鼠角膜移植模型60只。同基因移植組Wistar大鼠10只為供者，Wistar大鼠20只為受者；同種異體移植組Wistar大鼠10只為供者，SD大鼠20只為受者；同種異體移植+CsA治療組Wistar大鼠

8、10只為供者，SD大鼠20只為受者。各組術(shù)后不同時間點(diǎn)(3d，7d，12d，18d)隨機(jī)取5只大鼠進(jìn)行角膜移植排斥反應(yīng)指數(shù)評分，并于各時間點(diǎn)取角膜植片，固定，切片。HE染色光鏡下觀察角膜植片病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)染色(SABC法)檢測NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)。每張切片角膜傷口區(qū)隨機(jī)取5個200倍視野，計算陽性細(xì)胞率(陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù))，取其平均值作為該標(biāo)本各檢測指標(biāo)的表達(dá)率。 結(jié)果 一、正常的

9、大鼠角膜中，NF-κB及其下游因子ICAM-1、VEGF在角膜上皮層細(xì)胞內(nèi)有較弱的基礎(chǔ)表達(dá)，主要表達(dá)在基底層細(xì)胞；而在角膜基質(zhì)層及內(nèi)皮細(xì)胞未見陽性表達(dá)。NF-κB、ICAM-1、VEGF在正常大鼠角膜的表達(dá)部位具有良好的一致性，三者的表達(dá)強(qiáng)度分別為：4.85±1.37；3.78±1.44；5.12±1.54 二、角膜新生血管大鼠模型中，對照組在術(shù)后早期出現(xiàn)角膜新生血管，隨術(shù)后各時間點(diǎn)逐漸增多，到術(shù)后18d，新生血管幾乎在每個象限

10、均生長至角膜中央；治療組明顯抑制角膜新生血管生長(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示：NF-κB與ICAM-1、VEGF分布于角膜上皮、基質(zhì)層、角膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，三者的表達(dá)部位一致，表達(dá)強(qiáng)度隨術(shù)后各時間點(diǎn)逐漸增強(qiáng)。各時間點(diǎn)地塞米松治療組角膜中NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)低于生理鹽水組(P＜0.05)。對比觀察發(fā)現(xiàn)：NF-κB表達(dá)強(qiáng)度與CNV評分成正相關(guān)(r=0.961，P=0.000)，且與下游基因ICAM-1(r=0.9

11、22，P=0.000)、VEGF(r=0.958，P=0.000)的表達(dá)強(qiáng)度成正相關(guān)。 三、角膜移植大鼠模型中，在觀察期18d內(nèi)，同基因組無1例出現(xiàn)排斥反應(yīng)，同種異體組在各時間點(diǎn)的排斥反應(yīng)指數(shù)顯著高于同基因組(P＜0.05)，而同種異體移植+CSA治療組排斥反應(yīng)較同種異體移植組明顯受到抑制(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示：NF-κB與ICAM-1、VEGF分布角膜上皮層、基質(zhì)層及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。各時間點(diǎn)，同種異體移植組角膜中

12、NF-κB與ICAM-1、VEGF的表達(dá)高于同基因移植組(P＜0.05)，而低于同種異體移植+CsA治療組(P＜0.05)。對比觀察發(fā)現(xiàn)：NF-κB表達(dá)強(qiáng)度與排斥反應(yīng)指數(shù)(RI)成正相關(guān)(rs=0.901，P=0.000)，且與下游基因ICAM-1(r=0.833，P=0.000)、VEGF(r=0.935，P=0.000)的表達(dá)強(qiáng)度成正相關(guān)。 結(jié)論 一、正常大鼠角膜上皮細(xì)胞層存在著NF-κB與ICAM-1、VEGF的表

13、達(dá)，表達(dá)特征與以往實驗結(jié)果一致，研究正常大鼠角膜組織中NF-κB及其下游因子VEGF、ICAM-1的表達(dá)，有助于進(jìn)一步探索NF-κB在角膜病尤其是角膜移植排斥反應(yīng)和角膜新生血管中的作用機(jī)理。 二、NF-κB參與角膜新生血管的形成。NF-κB與VEGF、ICAM-1的表達(dá)部位與表達(dá)強(qiáng)度有著明顯的一致性，NF-κB可能通過上調(diào)下游基因VEGF、ICAM-1等基因的表達(dá)參與角膜新生血管的形成。地塞米松通過減弱NF-κB活性，抑制受其調(diào)