雷帕霉素抑制大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)的實驗研究.pdf

1、目的：角膜病是眼科的常見病和多發(fā)病，也是主要的致盲原因之一。角膜移植是重要復(fù)明手術(shù)，也是治療某些頑固性角膜病變的主要措施。由于角膜是免疫赦免組織，角膜移植術(shù)是目前同種器官移植成功率最高的手術(shù)。然而角膜移植免疫排斥反應(yīng)仍是角膜移植失敗的主要原因。目前臨床抑制角膜移植排斥反應(yīng)的藥物有皮質(zhì)類固醇激素、環(huán)孢霉素A(cyclosporinA，CsA)及他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)，雖然大大地提高了角膜移植的成功率及植片長期存活率，

2、仍有部分患者排斥不能被控制，因此尋找高效低毒的免疫抑制劑一直是防治角膜移植排斥反應(yīng)的主要問題。雷帕霉素(rapamycin，RPM)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素，后期研究發(fā)現(xiàn)它具有強大的免疫抑制作用，在不同種類的移植模型及自身免疫性疾病動物模型上顯示出顯著的抗排斥反應(yīng)活性，是一種療效好、低毒、無腎毒性和神經(jīng)毒性的新型免疫抑制劑。但RPM在角膜移植動物模型的應(yīng)用報道極少，僅見全身用于大鼠低危角膜移植模型中顯著延長角膜植片存活時間的初淺研究

3、報告。為了避免RPM全身應(yīng)用的毒副作用，本研究旨在對RPM滴眼液眼局部應(yīng)用的安全性及抑制角膜移植排斥反應(yīng)的藥效學(xué)進行研究，觀察與CsA聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同作用，并對其作用機制進行初步探討，以期為臨床角膜移植免疫排斥反應(yīng)的防治提供新的綜合治療方案。 方法：1.RPM滴眼液的眼部刺激性及安全性評價，SD大鼠20只，隨機分成4組，右眼分別滴用滴眼液基質(zhì)，0.1％RPM滴眼液、0.2％RPM滴眼液、0.4％RPM滴眼液，按眼部刺激性試驗評分標(biāo)

4、準(zhǔn)評分，評價各濃度RPM滴眼液的·1·刺激性；觀察其全身狀態(tài)及眼部損害，并對角膜及心、肝、脾、肺、腎行組織病理學(xué)檢查。 2.RPM滴眼液抑制大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的藥效學(xué)評價，建立大鼠低危穿透性角膜移植動物模型，以SD大鼠為受體，Wistar大鼠為供體，隨機分為6組。手術(shù)后第2天起分別以滴眼液基質(zhì)、0.05％RPM滴眼液、0.1％RPM滴眼液、0.2％RPM滴眼液、1％CsA滴眼液，每次100μl滴眼；0.2％RPM滴眼液與1％C

5、sA滴眼液聯(lián)合用藥組每次各50μl滴眼，每日4次，用藥至排斥反應(yīng)發(fā)生，未發(fā)生排斥反應(yīng)的動物模型，用藥至術(shù)后42天終止實驗。對角膜植片進行臨床觀察，記錄角膜植片存活時間。3.RPM滴眼液抑制大鼠角膜移植排斥反應(yīng)作用機制的研究，建立大鼠低危穿透性角膜移植動物模型，以SD大鼠為受體，Wistar大鼠為供體，隨機分為4組。手術(shù)后第2天起分別以滴眼液基質(zhì)、0.2％RPM滴眼液、1％CsA滴眼液，每次100μl滴眼；0.2％RPM滴眼液與1％CsA

6、滴眼液聯(lián)合用藥組每次各50μl滴眼，每日4次。術(shù)后14天，對術(shù)眼角膜行組織病理學(xué)檢查及應(yīng)用RT-PCR方法行細胞因子mRNA的檢測。4.RPM滴眼液防治大鼠高危角膜移植排斥反應(yīng)的實驗研究，建立大鼠高危穿透性角膜移植動物模型，以SD角膜新生血管化大鼠為受體，Wistar大鼠為供體，隨機分為4組。手術(shù)后第2天起分別以滴眼液基質(zhì)、0.2％RPM滴眼液、1％CsA滴眼液，每次100μl滴眼；0.2％RPM滴眼液與1％CsA滴眼液聯(lián)合用藥組各50

7、μl滴眼，每日4次，用藥至排斥反應(yīng)發(fā)生。對角膜植片進行臨床觀察，記錄角膜植片存活時間，并行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：1.滴眼液基質(zhì)、0.1％RPM滴眼液、0.2％RPM滴眼液局部應(yīng)用眼刺激評分均為0分；0.4％RPM滴眼液為1.20分。角膜上皮無熒光素鈉染色。各組大鼠飲食正常、營養(yǎng)良好，體重均增加；未見結(jié)膜、角膜、虹膜、晶狀體、視網(wǎng)膜的損害；組織病理學(xué)檢查角膜及心、肝、脾、肺、腎未見異常改變。 2.各用藥組角膜植片的存活率顯著高于對

8、照組(P＜0.01)；0.2％RPM滴眼液組優(yōu)于0.05％RPM滴眼液組及0.1％RPM滴眼液組(與0.05％RPM組比較：P＜0.01；與0.1％RPM組比較：P＜0.05)，抑制作用最強；0.2％RPM滴眼液與1％CsA滴眼液聯(lián)合用藥產(chǎn)生協(xié)同作用，優(yōu)于其它單獨用藥·2·組(與0.2％RPM組比較：P＜0.05；與其它各組比較：P＜0.01)；各濃度RPM滴眼液組與1％CsA滴眼液組比較差異無顯著性(P＞0.05)。 3.組織

9、病理學(xué)檢查，術(shù)后第14天各用藥組角膜植片炎細胞浸潤、新生血管形成及水腫程度均明顯輕于對照組，角膜植片中央?yún)^(qū)未見炎細胞浸潤及新生血管。細胞因子檢測顯示正常大鼠角膜組織中IL-1β、IFN-γ及PFP的mRNA均呈低表達；術(shù)后第14天對照組角膜組織IL-1β、IFN-γ及PFP的mRNA表達均顯著增高，與正常組比較有顯著差異(P＜0.01)；各用藥組角膜組織IL-1β、IFN-γ及PFP的mRNA表達均顯著下降，與對照組比較有顯著差異(P＜

10、0.01)。 4.各高危組角膜植片的存活時間分別為7.67±1.03天、16.67±1.63天、15.50±2.43天、21.33±2.94天，各用藥組角膜植片的存活時間與對照組比較顯著延長(P＜0.01)；聯(lián)合用藥組優(yōu)于單獨用藥組(P＜0.01)；0.2％RPM滴眼液組與1％CsA滴眼液組比較差異無顯著性(P＞0.05)。角膜植片存活率的比較結(jié)果與植片存活時間比較結(jié)果相一致。組織病理學(xué)檢查，術(shù)后第14天各用藥組角膜植片炎細胞浸

11、潤、新生血管形成及水腫程度均明顯輕于對照組，聯(lián)合用藥組角膜植片中央?yún)^(qū)未見炎細胞浸潤及新生血管。 結(jié)論：1.滴眼液基質(zhì)及0.4％以下濃度的RPM滴眼液眼局部應(yīng)用安全，無刺激性及毒性。 2.0.05％、0.1％及0.2％的RPM滴眼液均能顯著延長大鼠角膜植片的存活時間，抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)，具有隨濃度增加的效應(yīng)，0.2％的RPM滴眼液抗排斥作用最強；0.2％RPM滴眼液與1％CsA滴眼液聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，優(yōu)于單獨用藥