SCN1A基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆與初步鑒定.pdf

1、癲癇(epilepsy)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，人群患病率0.5～1％。目前傾向認(rèn)為特發(fā)性癲癇是一種離子通道病。電壓門(mén)控性鈉通道在興奮性細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用，它選擇性通透鈉離子，參與動(dòng)作電位的產(chǎn)生與傳播。Nav1.1在動(dòng)作電位發(fā)放的初始階段起著重要的作用，而編碼Nav1.1 α亞基的SCN1A基因與癲癇的發(fā)牛密切相關(guān)。目前已從全面性癲癇伴熱性驚厥附加綜合征(GEFS+)、頑固性兒童強(qiáng)直陣攣性癲癇(ICEGTC)、嬰兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇(

2、SMEI/Dravet Syndrome)和臨界的SMEI(SMEB)等多種癲癇患者中發(fā)現(xiàn)SCN1A基因的點(diǎn)突變。在正常哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，SCN1A基因的表達(dá)具有明顯時(shí)空性。實(shí)驗(yàn)證明，SCN1A基因敲除鼠(+/-)出現(xiàn)癲癇發(fā)作，表明SCN1A基因的表達(dá)水平與癲癇密切相關(guān)，而基因的核心啟動(dòng)子及其上游調(diào)控區(qū)域?qū)τ诨虻臅r(shí)空表達(dá)起關(guān)健作用。目前為止，SCN2A、SCN5A、SCNSA的肩動(dòng)子區(qū)和基本特性已研究確定，而SCN1A基因的啟動(dòng)子區(qū)

3、的研究還沒(méi)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的目的是克隆SCN1A基因的5’側(cè)翼區(qū)片段，初步確定SCN1A基因核心啟動(dòng)子及其上游調(diào)控序列，利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)肩動(dòng)子區(qū)的順式作用元件及反式作用因子，并觀察SCN1A基因表達(dá)的組織特異性。 方法： 提取正常人外周血基因組DNA作為模板，利用7對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲取SCA1A基因5’側(cè)翼區(qū)不同長(zhǎng)度的片段：P1(-1～-4897 bp)，P2(-1～-2985 bp)，P3(-1～-2392bp)

4、，P4(-1～-1936 bp)，P5(-1～-1688 bp)，P6(-1～-1479 bp)和P7(-1480～-4897bp)(起始密碼子ATG的第一個(gè)字母設(shè)為+1)。將上述片段克隆到pGL4.10載體，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因系列重組質(zhì)粒：pGL4-P1～pGL4-P7。將上述重組質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共同轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞和HEK293細(xì)胞，然后利用雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液的相對(duì)熒光活性(Fpn/Ftk)。

5、確定SCN1A基因核心肩動(dòng)子所在的區(qū)域后，比較SCN1A基因啟動(dòng)子在不同類(lèi)型細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，并利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)肩動(dòng)子區(qū)的順式作用元件及反式作用因子。 結(jié)論： 1，初步確定SCN1A基因核心啟動(dòng)子位于-1479～-1688bp區(qū)段內(nèi)。 2，SCN1A基因啟動(dòng)子活性與細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)，在神經(jīng)組織特異性細(xì)胞(SH-SYSY)中具有活性，而在其他組織細(xì)胞(HEK293)中沒(méi)有活性。 3，預(yù)測(cè)得到27個(gè)SCN1