Ⅲ型鈉通道SCN3A基因啟動(dòng)子區(qū)c-Fos轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的功能分析.pdf

1、背景：Ⅲ型鈉離子通道α亞基編碼基因SCN3A的表達(dá)存在時(shí)空特異性，并受嚴(yán)格的調(diào)控。它主要在胚胎和新生期中樞神經(jīng)系統(tǒng)中呈高表達(dá)，出生后明顯減少。癲癇、精神發(fā)育遲滯、孤獨(dú)癥、脊髓損傷后產(chǎn)生的神經(jīng)病理性疼痛等神經(jīng)系統(tǒng)疾病與SCN3A基因表達(dá)異常有關(guān)。該基因的啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的異常調(diào)控很可能是導(dǎo)致病理情況下 Nav1.3表達(dá)增多的原因。c-Fos是一種真核生物早期基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，在人及哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。c-

2、Fos對(duì)鈉通道基因的表達(dá)調(diào)控迄今還未見報(bào)道。
　　目的：本研究通過鑒定 hSCN3A基因啟動(dòng)子和上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，以及通過生物信息學(xué)分析hSCN3A基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，體外證實(shí)c-Fos調(diào)控元件的生理功能，以期進(jìn)一步探討SCN3A基因時(shí)空表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理及其與癲癇發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。
　　方法：本課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建 hSCN3A基因啟動(dòng)子與熒光素酶報(bào)告基因pGL4.10的系列重組質(zhì)粒，現(xiàn)采用5′端截短方法構(gòu)建不同長度的

3、hSCN3A基因啟動(dòng)子與熒光素酶報(bào)告基因pGL4.10的系列重組質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞后，根據(jù)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定的相對(duì)熒光素值，統(tǒng)計(jì)分析 hSCN3A基因啟動(dòng)子和上游調(diào)控區(qū)域的相關(guān)功能。利用生物信息學(xué)分析 hSCN3A基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和上游序列的特征并預(yù)測(cè)與之相關(guān)的調(diào)控元件，選擇預(yù)測(cè)的c-Fos調(diào)控元件進(jìn)行功能研究。采用定點(diǎn)誘變的方法對(duì)c-Fos調(diào)控元件位點(diǎn)進(jìn)行缺失突變，構(gòu)建缺失突變后熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體（PGL4-F

4、1.1-cFos-del），分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞和NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞后，根據(jù)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定的相對(duì)熒光素值，統(tǒng)計(jì)分析調(diào)控元件的功能。為研究轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控元件的結(jié)合，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)質(zhì)粒，并在編碼轉(zhuǎn)錄因子序列前端插入編碼V5標(biāo)簽蛋白的序列，采取Western Blot實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白的表達(dá)。合成生物素標(biāo)記的帶有調(diào)控元件的DNA探針，采取凝膠阻滯的電泳遷移實(shí)驗(yàn)，分析探針與蛋白的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1. hSCN

5、3A基因最小功能啟動(dòng)子及其上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的鑒定
　　對(duì)hSCN3A基因啟動(dòng)子不同長度片段（F0.9、F0.7、F0.5、F0.3、F0.2、F0.1）的分析表明，F(xiàn)0.9和F0.7與F1.1比較，相對(duì)熒光素酶活性分別下降約30％和80%，這兩個(gè)區(qū)域?yàn)檎哉{(diào)控區(qū)域，該區(qū)域可能存在正性調(diào)控元件；在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-548到+174 bp區(qū)活性改變不明顯,為最小功能啟動(dòng)子。
　　2. hSCN3A基因啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

6、>　　使用軟件預(yù)測(cè) hSCN3A基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的正性調(diào)控區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，同時(shí)我們選取預(yù)測(cè)的c-Fos轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行后續(xù)的功能研究。
　　3. hSCN3A基因啟動(dòng)子區(qū) c-Fos轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件上調(diào)報(bào)告基因表達(dá)，且需要 NGF參與
　　通過對(duì)c-Fos轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件敲除質(zhì)粒的活性分析，在PC12細(xì)胞中，野生型質(zhì)粒的活性與NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞相比較下降40%，而c-Fos del質(zhì)

7、粒無差異；在NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中，c-Fos del質(zhì)粒的活性與野生型質(zhì)粒相比較下降50%，而在PC12細(xì)胞中c-Fos del質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒活性無差異。結(jié)果表明，在PC12細(xì)胞中，只有在NGF誘導(dǎo)條件下，c-Fos元件才能顯著性上調(diào)hSCN3A基因啟動(dòng)子活性。
　　4. NGF上調(diào)PC12細(xì)胞內(nèi)源Scn3a基因表達(dá)的影響
　　使用RT-PCR和熒光定量PCR的方法對(duì)PC12細(xì)胞的內(nèi)源Scn3a基因表達(dá)進(jìn)行分析，RT

8、-PCR結(jié)果顯示，在NGF誘導(dǎo)情況下，PC12細(xì)胞的內(nèi)源 Scn3a基因 PCR的條帶濃度明顯較無NGF時(shí)高，同時(shí)熒光定量PCR顯示，在NGF誘導(dǎo)情況下，PC12細(xì)胞的內(nèi)源Scn3a的轉(zhuǎn)錄本明顯較無NGF時(shí)高，上述結(jié)果表明NGF能上調(diào)PC12細(xì)胞內(nèi)源性Scn3a基因表達(dá)。
　　5. c-Fos蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件不直接結(jié)合
　　為研究c-Fos與調(diào)控元件是否直接結(jié)合，本研究首先構(gòu)建V5-c-Fos融合表達(dá)載體，并采用Weste

9、rn Blot實(shí)驗(yàn)證明異源表達(dá)的融合蛋白V5-c-Fos是否被運(yùn)至細(xì)胞核。采取凝膠阻滯的電泳遷移實(shí)驗(yàn)，觀察 V5-c-Fos蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的DNA片段的結(jié)合，結(jié)果顯示V5-c-Fos蛋白并未與調(diào)控元件直接結(jié)合。提示c-Fos蛋白可能以間接方式與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合。
　　結(jié)論：本研究鑒定了人SCN3A基因的最小功能啟動(dòng)子及其上游調(diào)控區(qū)的功能，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上-558到-549 bp范圍內(nèi)存在一個(gè)有功能的c-Fos調(diào)控元件，該元件