p23基因假定啟動子區(qū)調(diào)控元件的確認和研究.pdf

1、新基因p23定位于人染色體1p34.3，編碼由203個氨基酸殘基構(gòu)成的假定蛋白，已通過RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)技術(shù)、全長cDNA文庫檢索等技術(shù)確定了轉(zhuǎn)錄起始位點。在新基因的結(jié)構(gòu)和功能研究中，分析基因的表達調(diào)控規(guī)律是其重要研究內(nèi)容之一。為此，我們采用GeneRunner、Proscan和TFsearch等生物信息學(xué)軟件預(yù)測了p23基因及其變異體的5′調(diào)控區(qū)，對其假定的近端啟動子（距轉(zhuǎn)錄起始位點約

2、2kb）的核酸序列分析發(fā)現(xiàn)其序列中存在1個不典型TATAbox（TATAATAAT）、3個不典型的CAATbox（GGCCCAAT）、7個GCbox（GGGCGG）、1個E2F位點（ATCTCGCGCA）、2個AP1位點（TGASTCAG）和3個AP4位點（TGCAGCTCGTG）。同時，通過分析p23變異體自其轉(zhuǎn)錄起始位點起上游800bp的假定調(diào)控序列，也發(fā)現(xiàn)了1個不典型的TATAbox、3個不典型的CAATbox、6個GCbox、1

3、個AP1位點、1個E2F位點和1個AP4位點。
　　根據(jù)以上生物信息學(xué)分析，本文將根據(jù)p23假定啟動子區(qū)域構(gòu)建的截短體和突變體構(gòu)建入pGL3–Basic報告基因載體。通過熒光素酶分析比較了一系列重組體的轉(zhuǎn)錄相對活性，我們發(fā)現(xiàn)p23基因假定近端啟動子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控功能，尤其是以第二個CAATbox（–166bp～–169bp）和第三個CAATbox（–256bp～–259bp）作用顯著，是關(guān)鍵的調(diào)控元件。此外，針對CAATbox

4、而構(gòu)建的突變體P2m1、P2m2、P2m3的雙熒光素酶相對活性分析結(jié)果也證實以上結(jié)論。在針對p23變異體的系列重組體進行的雙報告基因分析研究中，本研究還發(fā)現(xiàn)p23變異體轉(zhuǎn)錄起始位點上游第二個CAATbox（–228bp～–233bp）可明顯提高轉(zhuǎn)錄活性，因此它可能和其它CAATbox協(xié)同作用。進而應(yīng)用電泳遷移率變動分析（EMSA）確定p23基因的近端和遠端啟動子與轉(zhuǎn)錄因子Sp1之間存在相互作用，其確切位置極有可能是近端啟動子區(qū)上游172