IL-6和LPS對HaCaT細胞IL-15表達的調(diào)控研究及其啟動子區(qū)調(diào)控元件的鑒定.pdf

1、目的:(1)探討IL-6和LPS對HaCaT細胞IL-15表達的影響及其相關(guān)信號通路;(2)構(gòu)建IL-15基因系列啟動子熒光素酶報告基因載體,分析IL-15基因啟動子活性從而鑒定其關(guān)鍵調(diào)控元件。
　　方法:(1)培養(yǎng)HaCaT細胞,用IL-6和LPS分別處理,Real-time PCR分析IL-6和LPS對IL-15mRNA水平表達的影響;Western-Blot分析IL-6和LPS對IL-15蛋白水平表達的影響。同時Wester

2、n-Blot分析IL-6和LPS對HaCaT細胞信號通路 MAPKs-ERK1/2和 PI3K-AKT激活的改變,再使用其特異性抑制劑阻斷IL-6和LPS激活的相關(guān)信號通路,檢測IL-15的表達改變,從而探討這些信號通路與HaCaT細胞IL-15表達之間的關(guān)系。(2)通過PCR方法從HaCaT細胞基因組中克隆七段逐步缺失的IL-15基因啟動子序列;分別重組到含螢火蟲熒光素酶的報告基因載體pGL3-Basic質(zhì)粒上,構(gòu)建IL-15基因系列

3、啟動子熒光素酶報告基因載體;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染至HaCaT細胞,同時并轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶報告基因載體作為內(nèi)參照,給予IL-6和LPS分別處理;刺激后采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測IL-15啟動子活性,分析并鑒定IL-15啟動子區(qū)關(guān)鍵調(diào)控元件。
　　結(jié)果:(1)IL-6和LPS均顯著誘導HaCaT細胞中IL-15mRNA水平和蛋白水平的表達。信號通路分析發(fā)現(xiàn)IL-6和LPS均能顯著激活信號蛋白ERK1/2、AKT的磷酸化,當用特異

4、性抑制劑阻斷ERK1/2、AKT磷酸化后,IL-6和LPS對IL-15表達的誘導作用也被明顯抑制。(2)從HaCaT細胞基因組中經(jīng)PCR方法克隆出七段逐步缺失的IL-15基因啟動子片段,重組到熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic質(zhì)粒后,PCR及雙酶切鑒定證明各重組體構(gòu)建成功;含IL-15基因最長啟動子的重組體瞬時轉(zhuǎn)染HaCaT細胞后IL-6和LPS分別刺激,然后經(jīng)報告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)其具有明顯啟動子活性。
　　結(jié)論:(1)IL