擬南芥4CL cDNA的克隆及其對酵母的遺傳轉化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本課題研究利用金磁微球法提取得到擬南芥總RNA，然后利用RT-PCR法克隆出4CL(4CL)基因cDNA序列，構建了其克隆載體Pgem-Easy-4CL。通過測序對其進行序列分析后，進一步構建其畢赤酵母表達載體pPIC3.5K.4CL，然后利用電擊法轉化畢赤酵母GSll5，經甲醇誘導重組酵母表達，取得了如下進展： 利用RT-PCR法從擬南芥中擴增出4-香豆酸：輔酶A連接酶基因編碼序列，構建了克隆載體Pgem-TEasy-4CL。

2、通過PCR和酶切初步鑒定J下確后，對其進行測序，測序結果和NCBI中登陸號為NM_001 084228.1的4CLcDNA序列比對，同源性為99％。表明4-香豆酸：輔酶A連接酶基因已經成功克隆并連接至克隆載體Pgem-Teasy中。 設計分別帶有BamtH和Not I兩個酶切位點的4-香豆酸：輔酶A連接酶基因引物，以Pgem-Teasy-4CL為模板，擴增出5'端和3'端分別帶有BamHI和Not I兩酶切位點的4CL基因，然后

3、用這兩種酶切后連接至畢赤酵母表達載體pPlC3.5K中。重組表達載體Ppic3.5K.4CL。轉化大腸桿菌DH5a并利用其上攜帶的氨芐青霉素抗性基因篩選出抗性菌株，然后做PCR及雙酶切鑒定。經鑒定4-香豆酸：輔酶A連接酶基因已經準確地連接到畢赤酵母表達載體Ppic3.5K中。 用電轉化法將重組酵母表達載體Ppic3.5K-4CL，導入甲醇型酵母(P.Pastoris)菌株GSll5中，獲得轉化子。將轉化子采用營養(yǎng)缺陷、遺傳霉素、

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