農(nóng)桿菌介導(dǎo)慈竹4CL基因遺傳轉(zhuǎn)化梁山慈竹的研究.pdf

1、木質(zhì)素是一類(lèi)酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，在植物體內(nèi)行使重要的生理功能，但它卻是形成造紙污染的主要來(lái)源。由于竹子難以開(kāi)花，不適于應(yīng)用傳統(tǒng)方法進(jìn)行遺傳改良。因此，利用基因工程手段，在分子水平調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生物合成，以培育適合造紙的新竹種，具有較大的應(yīng)用價(jià)值和環(huán)保效益。已有大量的研究表明，抑制植物內(nèi)源4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)的基因表達(dá)可有效降低木質(zhì)素含量，因此，4CL是改良造紙用材較為理想的目標(biāo)基因。本研究室構(gòu)建了慈竹PBI121-4CL-RNA

2、i表達(dá)載體，但缺少竹子遺傳轉(zhuǎn)化體系。目前，竹分子生物學(xué)和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究十分落后，還沒(méi)有建立適合遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)體系，尤其是工業(yè)用大型叢生竹的研究。因此，開(kāi)展梁山慈竹遺傳轉(zhuǎn)化體系研究和梁山慈竹轉(zhuǎn)4CL基因植株的獲得十分重要。
　　 本研究以梁山慈竹兩種不同類(lèi)型的愈傷組織和無(wú)菌苗嫩莖為材料，采用農(nóng)桿菌遺傳介導(dǎo)的方法，將已構(gòu)建好的具有降低木質(zhì)素含量的PBI121-4CL-RNAi表達(dá)載體導(dǎo)入受體材料，探討愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度

3、、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和溫度、AS(乙酰丁香酮)等因素對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 初步建立了梁山慈竹遺傳轉(zhuǎn)化體系，以預(yù)培養(yǎng)8天的第一種類(lèi)型(淡黃色、顆粒狀、疏松易碎)的胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，在菌液濃度為OD600=0.05的EHA105中，28℃、110 rpm條件下，侵染20 min，然后在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2天(共培養(yǎng)基表面加一層無(wú)菌濾紙)，在含有卡那霉素為55 mg·L-1的抗性篩選培養(yǎng)基上

4、篩選30天，獲得的抗性愈傷組織，其在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，可獲得叢生芽，待叢生芽長(zhǎng)至3～5 cm后，在生根培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)20～30天的誘導(dǎo)，可產(chǎn)生1～8條根，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
　　 對(duì)抗性愈傷組織和抗性植株經(jīng)PCR檢測(cè)表明，慈竹4CL基因已導(dǎo)入梁山慈竹愈傷組織和再生植株中，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率為9％。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)4CL基因的梁山慈竹愈傷組織和植株的內(nèi)源4CL基因的表達(dá)受到抑制，且表達(dá)量比對(duì)照明顯降低。為