流感病毒感染樹鼩模型的建立及樹鼩呼吸道唾液酸受體的分布研究.pdf

1、流感病毒是引起人類呼吸道疾病的重要病原體，感染后表現(xiàn)為急性呼吸道疾病，具有起病急、發(fā)病快的特點(diǎn)；流感嚴(yán)重危害人類健康，尤其對(duì)老年人、嬰幼兒和免疫功能低下人群，可引起致死性肺炎。采用相關(guān)動(dòng)物模型來研究流感病毒發(fā)病機(jī)理和傳播方式有助于認(rèn)識(shí)疾病規(guī)律和指導(dǎo)公共衛(wèi)生管理，但是目前已有的流感動(dòng)物模型存在一定的不足，我們需要尋找更具臨床模擬性的良好動(dòng)物模型。樹鼩是形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物，它在生物學(xué)特征、新陳代謝、生理生化和基因組等方面與人類近似，被認(rèn)

2、為是有望代替靈長類動(dòng)物的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前，樹鼩已被廣泛用于生命科學(xué)研究，尤其是作為人類疾病動(dòng)物模型，包括病毒感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等疾病模型。
　　【目的】：
　　本論通過觀察樹鼩被流感病毒感染后的癥狀表現(xiàn)、病毒復(fù)制力、組織器官病理特征、體液免疫、固有免疫反應(yīng)等建立穩(wěn)定的流感樹鼩模型；初步探索樹鼩呼吸道組織唾液酸受體及受體轉(zhuǎn)移酶的分布。
　　【方法】：
　　1．流感病毒感染樹鼩以觀察癥狀及排毒：選取30

3、只無中和抗體的成年樹鼩，戊巴比妥鈉麻醉后，滴鼻接種甲型流感病毒（人H1N1流感病毒和禽H9N2流感病毒）（>106TCID50）200μl/只，每組15只；感染前3天至感染后14天，每天監(jiān)測(cè)樹鼩體溫，記錄體重（n=5）；感染后第3、6天進(jìn)行鼻灌洗，采用細(xì)胞病變法（CPE法）測(cè)定鼻灌洗液的病毒滴度。
　　2．流感病毒（H1N1）感染樹鼩以觀察組織器官的病理特征、體液免疫、固有免疫反應(yīng)：選取16只無中和抗體的成年樹鼩，戊巴比妥鈉麻醉后

4、，其中12只滴鼻感染流感病毒（H1N1）（>106TCID50）200μl/只，4只滴鼻等量的病毒液溶劑。感染后第2、4、6天使用戊巴比妥鈉麻醉樹鼩，心臟采血后（n=4）在無菌環(huán)境下解剖樹鼩取得鼻甲骨、氣管和肺組織，部分勻漿用于提取RNA檢測(cè)細(xì)胞因子和趨化因子在 mRNA水平的表達(dá)含量；另一部分固定、切片進(jìn)行 HE染色觀察組織病理變化以及進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)；第14天麻醉后心臟采血通過微量中和實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)血清中和抗體效價(jià)。
　　3、流感病

5、毒感染體外培養(yǎng)的樹鼩原代組織：無菌環(huán)境下取得肺、氣管和鼻甲骨等組織；剪成約2mm×2mm大小的組織塊，加入F-12K培養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)。取材后3小時(shí)內(nèi)分別感染106 TCID50的H1N1、H3N2、H9N2流感病毒；2h后棄去病毒液，以PBS洗3次，換為含1.5μg/mlTPCK胰酶的新鮮F-12K培養(yǎng)基，34℃培養(yǎng)，在感染后1,24,48和72h取上清進(jìn)行病毒載量測(cè)定，組織勻漿提取RNA以檢測(cè)細(xì)胞因子和趨化因子在mRNA水平的表達(dá)

6、含量。
　　4、采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)樹鼩肺和上氣道中的唾液酸受體和受體轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行染色以探討唾液酸受體及轉(zhuǎn)移酶在樹鼩呼吸道組織中的分布。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】：
　　1、癥狀表現(xiàn)：感染人H1N1流感病毒和禽H9N2流感病毒的樹鼩均在感染后第3、4天出現(xiàn)體溫升高，平均可上升1℃左右。感染人H1N1流感病毒的樹鼩體重下降，尤其在感染后第2~6天體重下降幅度較大，最大下降幅度約14％，隨后體重緩慢回升；而感染禽H9N2流感病毒

7、的樹鼩體重沒有明顯變化。
　　2、病毒復(fù)制力：滴鼻感染H1N1和H9N2的樹鼩在第3天和第6天的鼻灌洗液中都可檢測(cè)出具有感染力的病毒。樹鼩的鼻甲骨、氣管和肺組織在體外均可被流感病毒感染并成功復(fù)制，采用細(xì)胞病變法得病毒滴度范圍為在102.25TCID50~105.5TCID50之間，感染后48h病毒復(fù)制達(dá)高峰。
　　3、病理及免疫組化：病理切片HE染色顯示感染H1N1流感病毒后樹鼩的鼻甲骨、氣管和肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞滲出、

8、肺間質(zhì)增寬等現(xiàn)象；免疫組化結(jié)果顯示樹鼩鼻甲骨存在流感病毒抗原。
　　4、固有免疫：樹鼩體內(nèi)感染H1N1流感病毒后上呼吸道組織部分細(xì)胞因子和趨化因子在 mRNA水平的表達(dá)上調(diào)；體外感染流感病毒也可以激發(fā)樹鼩的呼吸道組織產(chǎn)生免疫反應(yīng)，病毒相關(guān)炎癥因子 IL-6、TNF-a、IL-8、IL-10、RANTES、MIG、IFN-β在mRNA水平上的表達(dá)呈不同程度升高。
　　5、體液免疫：感染前和感染后第14天雙份血清中和抗體結(jié)果顯示

9、感染流感病毒后樹鼩血清中和滴度升高，最高滴度達(dá)446.7倍。
　　6、受體分布：樹鼩鼻甲骨同時(shí)表達(dá)Siaα2,6和Siaα2,3受體，氣管主要表達(dá)Siaα2,6受體，同時(shí)表達(dá)少量Siaα2,3受體，而肺組織中兩種受體均不表達(dá)。上氣道只表達(dá)Siaα2,6酶，Siaα2,3和Siaα2,6酶同時(shí)表達(dá)于下氣道，肺組織主要表達(dá)Siaα2,3酶。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】：
　　流感病毒可感染樹鼩，在樹鼩呼吸道組織內(nèi)進(jìn)行有效復(fù)制，能一定