退熱解毒靈抗呼吸道流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：退熱解毒靈是一種抗呼吸道病毒復(fù)方中藥制劑。本實(shí)驗(yàn)旨在研究退熱解毒靈體內(nèi)外抗流感病毒(Flu virus，F(xiàn)lu)的活性及作用方式。并進(jìn)一步觀察退熱解毒靈對小鼠流感病毒肺炎的藥效及其免疫學(xué)機(jī)制，為臨床廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.在體外實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)病毒感染細(xì)胞的過程，設(shè)立藥物直接滅活病毒、藥物抑制病毒感染和藥物對病毒穿入細(xì)胞后的抑制這三種作用方式。在微量細(xì)胞培養(yǎng)板上，通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)、噻唑蘭比色

2、法和空斑減數(shù)試驗(yàn)來檢測細(xì)胞存活率和病毒抑制率；通過病毒滴定檢測病毒滴度的變化。實(shí)驗(yàn)設(shè)立藥物病毒唑與抗病毒口服液對照組。
　　 2.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，以BALB/c小鼠經(jīng)鼻吸入流感病毒鼠適應(yīng)株A/FM/1/47(H1N1)，建立小鼠病毒性肺炎模型，并用退熱解毒靈進(jìn)行治療，設(shè)立藥物病毒唑與抗病毒口服液對照組。在病毒感染后第14天，觀察小鼠體重變化和存活情況，計算生存率。同時，摘取感染小鼠肺臟，稱重，計算肺指數(shù)，用微量血凝法測定肺組織勻漿

3、中病毒血凝滴度；記錄肺臟大體病變程度，肺臟福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察其組織病理學(xué)改變。
　　 制備脾細(xì)胞懸液，MTT法檢測T淋巴細(xì)胞增殖情況，生物活性法檢測T淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的能力。
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞儀，檢測小鼠靜脈血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分比及CD4/CD8比例。
　　 實(shí)時熒光定量PCR和Western-blot法檢測肺組織中細(xì)胞因子TNF-

4、α、IL-1β、MCP-1、IL-10的基因表達(dá)。
　　 采用雙抗體夾心法，檢測小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外實(shí)驗(yàn)：
　　 (1)退熱解毒靈直接滅活Flu各組中，隨著藥物濃度的增加，感染Flu細(xì)胞的CPE逐漸減輕、病毒的抑制率增加。當(dāng)藥物濃度為160μg/mL時，病毒抑制率為85.2％?？瞻邷p數(shù)率為80.1％。退熱解毒

5、靈對Flu的半數(shù)有效濃度IC50為10.2μg/mL；治療指數(shù)TI為9.7，優(yōu)于陽性對照抗病毒口服液(P<0.05)。
　　 (2)退熱解毒靈抑制Flu感染各組中，預(yù)先處理2h組的細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的CPE表現(xiàn)，MTT結(jié)果顯示各感染組的病毒抑制率與病毒對照組比較無顯著差異；8h后退熱解毒靈濃度的增高，病毒的滴度降低、病毒抑制率增大。當(dāng)藥物濃度為160μg/mL時，病毒抑制率為84.3％，空斑減數(shù)率為79.3％，對Flu的半數(shù)有效濃度

6、IC50為11.9μg/mL，治療指數(shù)TI為10.7，優(yōu)于陽性對照抗病毒口服液(P<0.05)。
　　 (3)退熱解毒靈對Flu穿入細(xì)胞后的抑制作用組中，隨著藥物濃度的增加，感染Flu細(xì)胞的CPE逐漸減輕、病毒的抑制率增加。當(dāng)藥物濃度為160μg/mL時，病毒抑制率為84.2％，空斑減數(shù)率為78.2％，對Flu的半數(shù)有效濃度IC50分別為11.1μg/mL、治療指數(shù)TI分別為10.3，優(yōu)于陽性對照抗病毒口服液(P<0.05)。<

7、br>　　 2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 (1)退熱解毒靈高低劑量組與病毒對照組比較，生存率明顯升高，體重下降得到改善，血凝滴度和肺指數(shù)都顯著降低。
　　 (2)病理學(xué)結(jié)果表明：經(jīng)退熱解毒靈治療后，各藥物組與病毒對照組相比，肺臟病理學(xué)改變有明顯的改善。
　　 (3)與正常對照組比較，病毒對照組小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，分泌IL-2和IFN-γ的能力下降(P<0.05)；與病毒對照組比較，退熱解毒靈治

8、療后T淋巴細(xì)胞增殖能力和分泌IL-2和IFN-γ能力，均顯著提高(P<0.05)。
　　 (4)與正常對照組和病毒對照組比較，退熱解毒靈治療各組CD3+、CD4+的百分比，明顯提高(P<0.05)，CD8+在退熱解毒靈中劑量治療組和病毒唑組是最高，但在高劑量組偏低。退熱解毒靈高劑量組CD4/CD8比值相對其它各組最高。
　　 (5)與正常對照組比較，病毒對照組肺組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-10

9、的基因表達(dá)，明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與病毒對照組比較，退熱解毒靈治療各組肺組織中MCP-1、TNF-α、IL-1β表達(dá)顯著減少(P<0.05)；而IL-10表達(dá)則增多(P<0.05)。
　　 (6)退熱解毒靈治療各組與病毒對照組比較，小鼠血清中TNF-α、IL-6明顯降低(P<0.05)，IL-4水平顯著減少(P<0.01)，IL-10、IL-2和IFN-γ顯著升高(P<0.01，p<0.05)。
　　 結(jié)論：

10、　　 1.退熱解毒靈對Flu具有較強(qiáng)的直接滅活作用，能明顯的抑制Flu在Hep-2細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。退熱解毒靈對Flu的直接滅活作用和抑制Flu感染細(xì)胞的作用強(qiáng)于陽性對照抗病毒口服液(P<0.05)。
　　 2.退熱解毒靈對小鼠流感病毒性肺炎有較好的治療作用，其可能的免疫學(xué)機(jī)制：
　　 1)抑制病毒在肺部的增殖的同時，減輕了病毒對肺組織的直接損傷。
　　 2)通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分泌，提高T淋巴細(xì)胞增殖能力，進(jìn)而