新生樹鼩乙肝模型的優(yōu)化及樹鼩感染HBV后體內(nèi)免疫相關(guān)因子IFN-γ、TNF-α的變化初探.pdf

1、目的:通過對新生樹鼩接種低拷貝數(shù)的人HBV血清，優(yōu)化樹鼩慢性感染人HBV模型;通過觀察樹鼩感染HBV后體內(nèi)免疫相關(guān)因子IFN-γ及TNF-α的表達(dá)情況，初步探討HBV感染過程中宿主的免疫反應(yīng)機(jī)制，以及通過調(diào)節(jié)免疫環(huán)節(jié)來優(yōu)化樹鼩感染HBV模型的可行性。
　　方法:
　　第一部分新生樹鼩感染人HBV模型的優(yōu)化，主要內(nèi)容有:新生樹鼩經(jīng)雙側(cè)大腿皮下接種低拷貝數(shù)(103copies/ml)人HBV血清，8周后定期以ELISA和PCR方

2、法動態(tài)觀察樹鼩血清和肝組織中HBV感染標(biāo)志物的消長，同時(shí)觀察樹鼩肝組織的病理改變。
　　第二部分分析樹鼩感染HBV后體內(nèi)免疫相關(guān)因子IFN-γ及TNF-α的水平，主要內(nèi)容有:18只HBsAg和/或HBV DNA陽性的樹鼩設(shè)為感染組，6只同期未接種HBV的正常樹鼩為對照組。對所有動物的血清和肝組織標(biāo)本開展如下檢測:①應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測免疫相關(guān)因子IFN-γ及TNF-α在肝組織中的mRNA表達(dá)水平;②應(yīng)

3、用免疫組織化學(xué)方法觀察肝組織中IFN-γ及TNF-α的表達(dá)情況;③應(yīng)用ELISA動態(tài)觀察樹鼩接種HBV后第8、12、16、20、24和28周時(shí)外周血的IFN-γ及TNF-α水平的變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分觀察期內(nèi)28只新生樹鼩接種后的結(jié)果為:①血清ELISA結(jié)果顯示，自接種后第8周血清樣本均陸續(xù)檢出HBsAg陽性(28/28，100％)，且呈持續(xù)波動，HBsAg持續(xù)陽性時(shí)間最長達(dá)22周，大部分動物20周后HBsAg轉(zhuǎn)為

4、陰性;其中，8只(28.6％)不同時(shí)間出現(xiàn)HBsAb陽性，呈一過性表現(xiàn);4只(14.3％)動物可檢測到HBeAg陽性;5只(17.9％)檢出HBeAb陽性;2只(7.1％)檢出HBcAb陽性。②血清或肝組織PCR結(jié)果顯示，自接種后第8周血清中即可檢測到低水平HBV DNA病毒拷貝數(shù)。此后，隨著接種后時(shí)間的延長，病毒拷貝數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，直至接種后第24周，所有動物血清中均檢測不到HBV DNA;肝組織中共9例(32.1％)樣本檢出HBV

5、DNA，且呈現(xiàn)低水平（101～103/ug肝組織總DNA），僅1只動物血清和肝組織中同時(shí)檢出HBV DNA。③動物肝組織HBcAg表達(dá)及主要病理改變有:HBcAg陽性細(xì)胞可在多數(shù)動物肝組織中(60.7％，17/28)表達(dá);大部分肝組織可見肝細(xì)胞濁腫，肝小葉內(nèi)可見少量單核或淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，并有個別點(diǎn)狀壞死;小部分肝組織未呈現(xiàn)明顯病理及組織學(xué)改變。
　　第二部分18只感染組與6只正常對照組樹鼩免疫相關(guān)因子水平:①qRT-PCR

6、檢測結(jié)果表明，感染組IFN-γ mRNA表達(dá)水平（0.291±0.098）高于對照組（0.096±0.046），兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;感染組TNF-αmRNA的表達(dá)水平（0.542±0.163）高于對照組（0.411±0.096），但兩組間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。②免疫組化結(jié)果顯示，兩組樹鼩肝組織內(nèi)IFN-γ蛋白的陽性率分別為66.7％(12/18)和0％(0/6)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性; TNF-α蛋白在感染組和對照組樹鼩肝組織中的陽性

7、率分別為88.9％(16/18)和16.7％(1/6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。③ELISA動態(tài)觀察外周血IFN-γ與TNF-α水平結(jié)果顯示，對照組樹鼩在任何時(shí)間點(diǎn)均未檢測到IFN-γ及TNF-α表達(dá);感染組各個時(shí)間點(diǎn)IFN-γ與TNF-α雖均有低水平檢出，但都在試劑盒檢測閾值之下。
　　結(jié)論:
　　1.低拷貝數(shù)(103copies/ml)人HBV血清能避免接種后迅速激活宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)而清除病毒，提高樹鼩血清HBsAg的檢出

8、率及延長HBsAb的出現(xiàn)時(shí)間，有望提高樹鼩慢性感染HBV率。
　　2.樹鼩在感染HBV過程中有與人類相似的血清學(xué)轉(zhuǎn)換過程及肝臟病理變化，是研究人類感染HBV相關(guān)領(lǐng)域的較理想的模型動物。
　　3.感染HBV的樹鼩體內(nèi)免疫相關(guān)因子IFN-γ、 TNF-α的表達(dá)水平均高于正常樹鼩，提示樹鼩感染HBV后肝內(nèi)通過上調(diào)免疫相關(guān)因子的表達(dá)水平而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而在清除病毒以及影響病毒感染進(jìn)程起一定作用，即樹鼩感染HBV后可能具有與人類相似