足底電擊誘導(dǎo)樹(shù)鼩條件恐懼記憶模型的建立及抹除.pdf

1、目的:
　　痛覺(jué)和恐懼被認(rèn)為是有機(jī)體對(duì)外來(lái)傷害的一種有利的保護(hù)性行為，它的產(chǎn)生和建立對(duì)行為和健康有著強(qiáng)烈的影響。然而，如果痛覺(jué)和恐懼在不適當(dāng)?shù)臅r(shí)候被激活或者持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害。樹(shù)鼩作為類靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物，在解剖、生理、免疫及進(jìn)化等各方面與人類高度相似，因此，建立樹(shù)鼩恐懼記憶動(dòng)物模型可為研究人類相關(guān)疾病提供更好的動(dòng)物模型。
　　材料與方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)Ⅰ：探索樹(shù)鼩在明暗箱中的活動(dòng)規(guī)律該實(shí)驗(yàn)包含三個(gè)階段：訓(xùn)練階

2、段、適應(yīng)階段和實(shí)驗(yàn)階段。在訓(xùn)練階段，所有的動(dòng)物在無(wú)電刺激的情況下每天允許在明暗箱中自由活動(dòng)30min；在適應(yīng)階段，動(dòng)物被允許進(jìn)行環(huán)境及實(shí)驗(yàn)節(jié)奏的適應(yīng)，共持續(xù)3d；在實(shí)驗(yàn)階段，每只動(dòng)物進(jìn)行10min的測(cè)試（每次測(cè)試記錄前有3min的適應(yīng)時(shí)間以消除應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的誤差）。實(shí)驗(yàn)階段對(duì)動(dòng)物的處理與適應(yīng)階段一致，同時(shí)進(jìn)行動(dòng)物行為的記錄、處理與分析。分析記錄的行為指標(biāo)包括移動(dòng)距離、平均移動(dòng)速率、停留時(shí)間以及在兩箱之間的穿梭次數(shù)。本次實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

3、
　　2.實(shí)驗(yàn)Ⅱ：尋找電擊樹(shù)鼩足底合適的電壓該實(shí)驗(yàn)兩個(gè)隔室皆為明室（即都用LED提供照明）。這個(gè)實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)階段組成：適應(yīng)階段和測(cè)試階段。適應(yīng)階段與實(shí)驗(yàn)Ⅰ相應(yīng)階段一致。3d適應(yīng)性訓(xùn)練之后進(jìn)行測(cè)試階段的實(shí)驗(yàn)。在測(cè)試階段，動(dòng)物有10min的測(cè)試時(shí)間，在這10min內(nèi)，隨機(jī)選擇一個(gè)隔室給予電刺激。電刺激的程序?yàn)椋好扛?0s時(shí)間給10s的電刺激，電壓從0V遞增至20V，增幅為4V。本實(shí)驗(yàn)中在一個(gè)電壓下將所有動(dòng)物測(cè)試完后調(diào)至下一電壓進(jìn)行下一輪

4、測(cè)試，尋找合適的電擊電壓。
　　3.實(shí)驗(yàn)Ⅲ：樹(shù)鼩條件恐懼記憶的建立該實(shí)驗(yàn)由4個(gè)階段組成：適應(yīng)階段、刺激前階段、恐懼記憶形成階段、恐懼記憶維持階段。適應(yīng)階段的處理和實(shí)驗(yàn)Ⅰ中相應(yīng)階段一致。在恐懼記憶形成階段，動(dòng)物在明箱中不給予電擊，動(dòng)物一進(jìn)入暗箱中就給予合適足底脈沖電刺激，以建立恐懼記憶，并形成對(duì)黑暗的條件刺激。刺激電壓由穩(wěn)壓電源提供，電脈沖由時(shí)間繼電器控制。電脈沖刺激程序與實(shí)驗(yàn)Ⅱ中的電脈沖程序一致。所有動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)裝置時(shí)兩箱均為明箱

5、，在動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境之后隨機(jī)選擇一個(gè)隔室關(guān)LED燈，隨后進(jìn)行記錄。對(duì)照組不給電刺激，其他處理完全一致。所有動(dòng)物每天只進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)。
　　4.實(shí)驗(yàn)Ⅳ：樹(shù)鼩條件恐懼記憶的抹除在實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物形成條件恐懼7周后，啟動(dòng)記憶抹除實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)階段即原恐懼記憶維持階段、新恐懼記憶建立階段和原恐懼記憶抹除階段。在新恐懼記憶建立階段，動(dòng)物一到明箱就受到足底電擊刺激，刺激電壓由穩(wěn)壓電源提供，電脈沖由時(shí)間繼電器控制。電脈沖程序與實(shí)驗(yàn)Ⅲ中的電脈沖程序一致

6、，連續(xù)刺激4d。隨后的觀察階段撤去電刺激。所有動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)裝置時(shí)兩箱均為暗箱，在動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境之后隨機(jī)選擇一個(gè)隔室開(kāi)LED燈，隨后進(jìn)行記錄。每只動(dòng)物每天只進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)。
　　5.數(shù)據(jù)收集所有的實(shí)驗(yàn)均在14∶00～18∶00之間進(jìn)行的。在測(cè)試階段的10 min內(nèi)，動(dòng)物在每個(gè)隔間內(nèi)的活動(dòng)情況由攝像機(jī)記錄，通過(guò)行為學(xué)分析軟件EthoVision XT9（Noldus，Wageningen,the Netherlands）進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)出動(dòng)

7、物在每個(gè)隔間內(nèi)的停留時(shí)間（Duration）、移動(dòng)速率(Velocity)、移動(dòng)距離(Distance)、在兩隔室間的穿梭次數(shù)(Frequency)等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在處理視頻過(guò)程中，如果動(dòng)物處于兩個(gè)隔室的之間，我們規(guī)定以動(dòng)物的中心為參考點(diǎn)進(jìn)行處理。
　　6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示形式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±s）表示，數(shù)據(jù)的計(jì)算及統(tǒng)計(jì)圖表的生成由軟件Graph Pad Prism5.0

8、完成。實(shí)驗(yàn)Ⅰ和實(shí)驗(yàn)Ⅱ中的數(shù)據(jù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)Ⅲ和Ⅳ中的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1．實(shí)驗(yàn)Ⅰ：探索樹(shù)鼩在明暗箱中的活動(dòng)規(guī)律在沒(méi)有任何刺激情況下，讓樹(shù)鼩在明暗箱中自由活動(dòng)。結(jié)果顯示，樹(shù)鼩在暗箱中停留時(shí)間為（476.773±26.965） s,而明箱中只有（117.075±31.176）s。兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。樹(shù)鼩在明暗兩箱中的移動(dòng)距離

9、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），在兩箱中的移動(dòng)速率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其在兩箱間的穿梭次數(shù)為（21.42±4.245）次。以上結(jié)果表明樹(shù)鼩雖然是一種晝行性動(dòng)物，但更喜歡停留在暗箱之中；明箱中停留時(shí)間少、移動(dòng)距離大、平均速率高等特點(diǎn)與樹(shù)鼩白天外出覓食習(xí)性相符，表明樹(shù)鼩的活動(dòng)規(guī)律并沒(méi)有因?yàn)槊靼迪涠淖儭?br>　　2．實(shí)驗(yàn)Ⅱ：尋找電擊樹(shù)鼩足底合適的電壓在兩相同的明室中，僅在一室中給予不同電壓足底電擊，樹(shù)鼩（n=6）表現(xiàn)出不同的活動(dòng)特

10、征。0、4、8V電壓下，樹(shù)鼩在兩個(gè)隔室中的停留時(shí)間、移動(dòng)速率、移動(dòng)距離、穿梭次數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)電壓在12V以上，樹(shù)鼩在有電刺激的隔間停留時(shí)間開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。移動(dòng)速率和移動(dòng)距離在16V前均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），20V時(shí)移動(dòng)速率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。穿梭次數(shù)在16V以上時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由于20 V電壓下樹(shù)鼩的傷害較大，考慮到動(dòng)物的福利保護(hù)和更強(qiáng)的刺激效果遂選用16V電壓作

11、為合適電壓進(jìn)行電擊，并用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中。
　　3．實(shí)驗(yàn)Ⅲ：樹(shù)鼩條件恐懼記憶的形成動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=4，暗箱中給予足底電刺激）和對(duì)照組（n=4，無(wú)電刺激）。結(jié)果顯示，兩組樹(shù)鼩在電刺激前均喜歡在暗箱中活動(dòng)，符合樹(shù)鼩的喜暗習(xí)性。在電刺激后實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在明箱中的停留時(shí)間、移動(dòng)距離均增大（P<0.001），平均移動(dòng)速率減少（P<0.001）。而暗箱中則相反，其在暗箱中的停留時(shí)間、移動(dòng)距離均減少（P<0.001），平均移動(dòng)速率增大（P<

12、0.001）。樹(shù)鼩在兩箱間的穿梭次數(shù)減少（P<0.001）。以上結(jié)果表明樹(shù)鼩對(duì)暗箱的恐懼記憶已經(jīng)形成。
　　4．實(shí)驗(yàn)Ⅳ：樹(shù)鼩條件恐懼記憶的抹除在結(jié)束恐懼記憶維持階段后，啟動(dòng)記憶抹除實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在明箱中給予電刺激之前，實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩對(duì)暗箱的恐懼并未消退。在電刺激之后實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在明箱中的停留時(shí)間、移動(dòng)距離均減少（P>0.05），平均移動(dòng)速率增大（P>0.05）。而暗箱中則相反，其在暗箱中的停留時(shí)間、移動(dòng)距離均增大（P>0.05），平均