中緬樹(shù)鼩分子標(biāo)記方法的建立及其遺傳多樣性分析.pdf

1、樹(shù)鼩作為新興的模式動(dòng)物之一，因其在進(jìn)化地位上與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物親緣關(guān)系較為接近，且體型小，易馴養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)，以及存在諸多自發(fā)性疾病等特性，可作為某些人類(lèi)重大疾病研究的動(dòng)物模型，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)上已呈現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。目前，樹(shù)鼩已被應(yīng)用于病毒、神經(jīng)、免疫、腫瘤和社會(huì)生物學(xué)的研究，表現(xiàn)出對(duì)其應(yīng)用研究多于基礎(chǔ)研究的狀態(tài)，遺傳背景研究就更為少見(jiàn)，不利于實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化。本研究結(jié)合不同遺傳標(biāo)記方法的優(yōu)點(diǎn)，分別采用RAPD（Random amplifi

2、edpolymorphic DNA）和微衛(wèi)星DNA兩種分子標(biāo)記方法分析中緬樹(shù)鼩種群的遺傳結(jié)構(gòu)并評(píng)估其遺傳多態(tài)性，為開(kāi)展樹(shù)鼩繁育工作與實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化提供一定的理論基礎(chǔ)和遺傳檢測(cè)方法。
　　 針對(duì)目前樹(shù)鼩基因組信息未知，可供參考的遺傳信息匱乏等問(wèn)題，首先通過(guò)建立樹(shù)鼩RAPD遺傳標(biāo)記分析方法，了解樹(shù)鼩種群的遺傳多樣性。采用PCR技術(shù)對(duì)40條隨機(jī)引物進(jìn)行優(yōu)化，篩選出能有效用于樹(shù)鼩群體遺傳分析的RAPD位點(diǎn)，對(duì)48只樹(shù)鼩個(gè)體的基因組D

3、NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；應(yīng)用Popgene1.32與RAPDistancePackage Version1.04等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并分析樹(shù)鼩的群體遺傳特性。20個(gè)擴(kuò)增效果理想的RAPD引物在48個(gè)樹(shù)鼩個(gè)體中共檢測(cè)到113個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出5.65個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為69個(gè)（占61.1％）。樹(shù)鼩種群個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)平均為0.8307，個(gè)體間遺傳距離在0.09～0.27之間，平均遺傳距離為0.1693。雄性群體的遺傳多態(tài)度（H

4、o）（0.1864）略高于雌性群體（0.1470），平均遺傳多態(tài)度（Hpop）為0.1667；樹(shù)鼩遺傳多態(tài)度所占的比例在群體內(nèi)為48.29％，而雌、雄群體間為51.71％。NJ法進(jìn)行聚類(lèi)分析得出T15、T33和T47號(hào)樹(shù)鼩個(gè)體聚類(lèi)成一大類(lèi)，其余45只樹(shù)鼩個(gè)體聚成另一大類(lèi)，雌、雄個(gè)體呈相互交叉現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究的樹(shù)鼩群體具有較好的遺傳多樣性，實(shí)驗(yàn)所篩選的20條隨機(jī)引物和建立的RAPD標(biāo)記方法可有效用于樹(shù)鼩種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析和遺傳變

5、異監(jiān)測(cè)。
　　 為了進(jìn)一步研究中緬樹(shù)鼩種群的遺傳背景，結(jié)合微衛(wèi)星DNA標(biāo)記具有高度的多態(tài)性、共顯性遺傳、易于PCR穩(wěn)定擴(kuò)增等特點(diǎn)，參考國(guó)外學(xué)者從其它種類(lèi)的樹(shù)鼩分離的少數(shù)微衛(wèi)星座位引物，建立微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記方法分析樹(shù)鼩種群的遺傳多態(tài)性，并與RAPD方法得出的結(jié)果作相互驗(yàn)證。通過(guò)利用11個(gè)微衛(wèi)星座位對(duì)60只中緬樹(shù)鼩進(jìn)行PCR擴(kuò)增及12％非變性（中性）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)微衛(wèi)星DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選出9個(gè)能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定條帶的微衛(wèi)星

6、位點(diǎn)，并計(jì)算其等位基因數(shù)、等位基因頻率、多態(tài)性信息含量（PIC）、基因雜合度等指標(biāo)。9個(gè)微衛(wèi)星基因座共檢測(cè)到51個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為5.6667。TG22座位的雜期望合度值（H）最高，為0.8936，最低為T(mén)G1的0.5042，平均期望雜合度為0.7648。各微衛(wèi)星座位的多態(tài)信息含量值（PIC）在0.4985～0.8896之間，平均值為0.7588，表明該樹(shù)鼩種群具有較高的遺傳多樣性。選取6個(gè)微衛(wèi)星基因座的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列

7、測(cè)定分析，出現(xiàn)（AC）n或（AC）n的完全和不完全的核心序列；各座位同源性比對(duì)的變化范圍為75％～93％。結(jié)果表明，篩選的9個(gè)微衛(wèi)星基因座具有較豐富的遺傳多態(tài)性，可用于中緬樹(shù)鼩的遺傳多樣性分析。
　　 研究表明，該樹(shù)鼩種群具有較豐富的遺傳多態(tài)性；本研究建立的RAPD和微衛(wèi)星DNA兩種遺傳標(biāo)記方法均適用于分析中緬樹(shù)鼩種群遺傳結(jié)構(gòu)和評(píng)估其遺傳多樣性。多態(tài)性較高的樹(shù)鼩種群有利于動(dòng)物的繁殖育種，但要廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中還需要進(jìn)一步推