人流感病毒感染缺乏α-2,6唾液酸受體的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元研究.pdf

1、背景和目的：
　　傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，流感病毒是通過其病毒外殼上的血凝素（Hemagglutinin,HA），結(jié)合到宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體，而作為感染的起始步驟。早期研究發(fā)現(xiàn)，人流感病毒結(jié)合α-2,6唾液酸受體，而禽流感表達(dá)則結(jié)合α-2,3唾液酸受體。流感病毒唾液酸受體可以使用植物凝集素SNA、MAAⅠ、MAAⅡ進(jìn)行染色鑒定。SNA結(jié)合人流感病毒受體α-2,6唾液酸，MAAⅠ、MAAⅡ則結(jié)合禽流感病毒受體α-2,3唾液酸。但是一些最近

2、的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在流感病毒對細(xì)胞的感染與細(xì)胞唾液酸受體的分布并不一致的現(xiàn)象。
　　流感病毒感染除了導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病外，關(guān)于流感相關(guān)腦病和腦炎亦有報道。研究結(jié)果表明流感病毒可通過感染外周神經(jīng)系統(tǒng)和通過呼吸道嗅神經(jīng)-嗅球的途徑感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但是經(jīng)典的流感病毒受體在神經(jīng)元上是否表達(dá)以及流感病毒感染神經(jīng)元的感染機(jī)制還有待深入研究。
　　本研究建立了胎鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞模型，使用神經(jīng)氨酸酶消化神經(jīng)元膜上的唾液酸后，驗證了植物凝

3、集素染色的特異性。然后，通過植物凝集素的特異性染色，鑒定神經(jīng)元細(xì)胞上流感病毒受體的表達(dá)情況，并且使用人流感病毒毒株感染原代培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)元，以觀察分析人流感病毒在該神經(jīng)元內(nèi)的感染情況。
　　材料與方法：
　　神經(jīng)元的原代培養(yǎng)：取孕16-18天的C57BL/6胎鼠大腦皮層，經(jīng)木瓜蛋白酶消化以及機(jī)械吹打，接種于Neurobasal+B27培養(yǎng)基中，>90％的神經(jīng)元培養(yǎng)8天后神經(jīng)元成熟用于后續(xù)實驗。
　　尼氏染色鑒定神經(jīng)元：

4、通過甲苯胺藍(lán)對神經(jīng)元特異性尼氏小體進(jìn)行特異性染色，鑒定神經(jīng)元。
　　免疫熒光法檢測神經(jīng)元純度：使用免疫熒光法，通過特異性抗體，檢測神經(jīng)元特異性蛋白微管相關(guān)蛋白2（MAP2），對神經(jīng)元進(jìn)行染色鑒定，并使用DAPI染細(xì)胞核，通過計數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)（MAP2陽性）以及總細(xì)胞數(shù)（DAPI陽性），計算原代培養(yǎng)的神經(jīng)元陽性細(xì)胞率。
　　植物凝集素染色特異性的確定：使用神經(jīng)氨酸酶消化神經(jīng)元，然后再使用植物凝集素（SNA、MAAⅠ和MAAⅡ）

5、進(jìn)行染色，若染色結(jié)果為陰性，則表明植物凝集素是特異性地結(jié)合唾液酸受體的。
　　植物凝集素染色研究唾液酸受體表達(dá)情況：使用SNA、MAAⅠ和MAAⅡ三種植物凝集素孵育神經(jīng)元細(xì)胞，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素結(jié)合后，AEC顯色。
　　人流感病毒感染神經(jīng)元：本實驗使用兩株人流感病毒A/Nanchang/8002/2009(H1N1)和A/brisbane/59/2007(H1N1)對培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行感染，分別在感染后的不同時間

6、點收集感染的神經(jīng)元，以檢測流感病毒在其中的復(fù)制情況。
　　流感病毒RNA在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)：提取感染后的神經(jīng)元總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后使用熒光實時定量PCR的方法檢測流感病毒保守基因基質(zhì)蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而分析流感病毒在神經(jīng)元內(nèi)病毒RNA的復(fù)制情況。
　　流感病毒蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)：提取感染后的神經(jīng)元總蛋白，使用免疫印跡檢法測流感病毒核蛋白在感染的神經(jīng)元內(nèi)的蛋白表達(dá)情況。
　　免疫熒光法檢測流感病毒在神經(jīng)元內(nèi)的定位：將神經(jīng)元

7、與用流感病毒M1蛋白抗體孵育，用已感染的神經(jīng)元細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光檢測，觀察流感病毒在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　TCID50法檢測子代病毒釋放：收集感染后的上清，用TCID50法檢測子代病毒的釋放。
　　結(jié)果：
　　通過原代神經(jīng)元培養(yǎng)細(xì)胞的植物凝集素染色結(jié)果顯示，SNA信號呈陰性反應(yīng)，表明胎鼠神經(jīng)元不存在人流感病毒α-2,6唾液酸受體。相反，MAAⅠ和MAAⅡ染色均呈細(xì)胞膜上陽性反應(yīng)，也就表明胎鼠神經(jīng)元膜上存在著禽流感

8、病毒α-2,3唾液酸受體。然而，經(jīng)用神經(jīng)氨酸酶消化后的神經(jīng)元，植物凝集素染色結(jié)果均為陰性，表明SNA、MAAⅠ和MAAⅡ三種植物凝集素對唾液酸受體染色均為特異性的。
　　使用兩株人流感病毒感染胎鼠神經(jīng)元培養(yǎng)細(xì)胞，分別在感染6小時，12小時，24小時后收集已感染的神經(jīng)元，提取RNA，檢測流感病毒RNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，流感病毒隨時間的延長，其RNA在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)量隨之上升。同樣，使用免疫印跡檢測流感病毒核蛋白的表達(dá)情況，結(jié)

9、果顯示流感病毒核蛋白在感染的神經(jīng)元內(nèi)其表達(dá)水平與病毒RNA的表達(dá)水平呈相似的上升趨勢。另外，運用免疫熒光檢測流感病毒在神經(jīng)元內(nèi)M1蛋白的情況，兩株流感病毒的M1蛋白均能在感染24小時后檢測到。感染后6-48小時子代病毒的釋放呈上升趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.分離培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞存在禽流感病毒α-2,3唾液酸受體，不存在人流感病毒α-2,6唾液酸受體；
　　2.成功建立流感病毒感染神經(jīng)元細(xì)胞的模型；