Dok6在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元神經突起生長過程中的功能研究.pdf

1、Trk((t-)ropomyosin-(r-)elated(k-)inase，原肌球蛋白相關激酶)是細胞膜表面的一類重要酪氨酸激酶，其在神經細胞的存活、增殖、分化、遷移、凋亡以及學習和記憶等高級功能中都扮演著關鍵角色。Trk受體屬于受體酪氨酸激酶超家族，一共有三個家族成員：TrkA、TrkB和TrkC。他們的高親和力配體是神經營養(yǎng)因子（neurotrophins）家族，該家族成員包括NGF、BDNF、NT-3、NT-4等等。通過與神經營

2、養(yǎng)因子相結合，Trk受體迅速二聚化并激活其自身酪氨酸激酶活性，進而可以募集多種胞漿信號蛋白并將其磷酸化，從而將胞外信號傳遞至胞內。
　　 Dok((d-)ownstream(o-)ftyrosine(k-)inase/Dockingprotein)是一類重要的胞漿接頭蛋白，參與了多個信號通路的轉導。該家族由七個成員組成：Dokl至Dok7。Dok家族蛋白符合胞漿信號蛋白的典型結構特征：N端PH結構域、中央PTB結構域以及C末端區(qū)

3、域，因此可以作為多種非受體酪氨酸激酶（如Src家族激酶）及受體酪氨酸激酶（如胰島素受體、c-Ret受體、Trk受體等）的底物被募集及磷酸化，從而調節(jié)下游信號。
　　 本室前期工作表明Dok5可以與TrkB和TrkC受體相互作用并作為二者的底物激活MAPK信號通路。由于Dok5與Dok6均在神經系統(tǒng)特異性高表達，并且同源性分析結果顯示二者在同家族的七個成員中同源性最高，因此我們預測Dok6可能也參與神經系統(tǒng)中Trk受體家族的信號轉

4、導過程。接下來，首先利用酵母雙雜交系統(tǒng)進行了驗證。結果證明在酵母雙雜交系統(tǒng)中，Dok6與TrkC受體的胞內區(qū)有明顯相互作用，而與TrkA和TrkB的相互作用很弱。通過結構域分段克隆，進一步證明了Dok6是通過其PTB結構域與TrkC受體發(fā)生相互作用的。以上試驗結果在GST-pulldown和CoIP實驗中得到了進一步的證實。隨后利用氨基酸突變分析的方法明確了Dok6通過其PTB結構域結合于TrkC受體胞內區(qū)的NPQY模體，并且這種相互作

5、用依賴于受體的激酶活性。
　　 為了在神經系統(tǒng)內驗證上述相互作用，我們利用原位雜交及免疫熒光實驗證實TrkC受體與Dok6在來源于小鼠大腦皮層的原代培養(yǎng)的神經元中共定位，并且免疫沉淀實驗進一步在體內證實了二者的相互作用，提示Dok6在神經系統(tǒng)中作為TrkC受體的底物行使重要功能。通過RNA干擾技術，在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元中敲低Dok6的表達并證明其在神經突起的生長過程中發(fā)揮重要作用，隨后通過外源性NT-3的刺激證實Dok

6、6作為TrkC受體的底物通過NT-3/TrkC通路在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元的神經突起生長過程中發(fā)揮作用。最后，利用免疫沉淀及質譜鑒定的方法鑒定出可能與Dok6發(fā)生相互作用的26個蛋白，通過對其進行生物信息學分析最終鎖定9個參與了神經系統(tǒng)發(fā)育及細胞內信號轉導的靶蛋白。
　　 綜上所述，我們證實了Dok6依賴其PTB結構域結合于活化的TrkC受體的NPQY模體，并且作為TrkC受體的底物通過NT-3/TrkC通路在原代培養(yǎng)的小