中國石蒜(Lycoris chinensis)體內(nèi)加蘭他敏等生物堿積累影響因素的研究.pdf

1、石蒜科（Amatyllidaccae）植物以含有獨特的具有多種生物活性的生物堿化合物而為人關(guān)注。在這些生物堿中研究的最多的是加蘭他敏。加蘭他敏是一種異喹啉生物堿，也是乙酰膽堿酯酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)其在治療阿爾茨海默?。ê喎QAD.老年性癡呆癥早期癥狀）方面具有特殊的療效，是目前世界上廣泛應(yīng)用的治療輕至中度AD.的藥品。
　　 目前藥用加蘭他敏主要來源于兩種途徑：人工合成和從植物中提取。由于加蘭他敏人工合成步驟復(fù)雜，成本很高，目前植物

2、仍然是加蘭他敏等生物堿的重要來源。但由于加蘭他敏在石蒜中含量比較低，同時其市場需求量持續(xù)上升，自然資源已經(jīng)難以滿足人們的需求，而且長期挖掘自然資源必然會造成生態(tài)環(huán)境的破壞。如何對瀕危野生石蒜屬植物資源進行資源保護，如何提高石蒜體內(nèi)加蘭他敏和其它生物堿含量一直是藥用植物研究領(lǐng)域的熱點問題。本研究概述了世界各國利用生物工程技術(shù)的方法來提高加蘭他敏等生物堿的研究現(xiàn)狀，研究了中國特有種--中國石蒜（Lycorischinensis）的種子貯藏萌

3、芽特性，以及中國石蒜不同生長時間中，不同外植體來源的愈傷組織和芽中，以及部分生物和非生物誘導(dǎo)因素對中國石蒜體內(nèi)加蘭他敏、力克拉敏、石蒜堿、總生物堿含量的變化，并探討了加蘭他敏合成途徑中的重要酶--編碼兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的基因的表達量和加蘭他敏含量之間的關(guān)系，主要結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1.探討了適合于中國石蒜種子貯藏的最佳方法及種子萌芽的最佳條件。將新鮮中國石蒜種子（含水量72.37％）置于-80℃，-20℃，-4℃冰箱，硅膠，

4、室溫干燥貯藏一個月，測定其萌芽率，結(jié)果表明：新鮮中國石蒜不耐貯藏，在-80℃和-20℃，硅膠干燥貯藏一個月后很快失去發(fā)芽能力，室溫(10℃～30℃)濕沙層積，-4℃濕沙貯藏，均可以保持其生活力。本試驗結(jié)果表明，中國石蒜種皮對發(fā)芽有抑制作用，除去種皮后的種子萌芽時間縮短，萌芽率和萌芽勢均顯著高于帶種皮的種子。中國石蒜種子發(fā)芽需要短暫時間的低溫以完成春化作用，-4℃低溫層積，GA3處理能縮短萌芽時間，使萌芽整齊。光照與黑暗對萌芽率沒有顯著影

5、響。中國石蒜種子屬于脫水敏感型，隨著種子含水量的下降，種子的生活力也隨之降低，臨界含水量為51.10％，低于臨界含水量其生活力迅速下降。中國石蒜種子屬于低度頑拗性種子。
　　 2.研究了中國石蒜生長時間中加蘭他敏、力克拉敏、石蒜堿含量的變化。利用高效液相色譜(HPLC)對中國石蒜未萌發(fā)的種子，10天幼苗，3個月苗，1年生苗，多年生的中國石蒜植株的生物堿進行檢測，結(jié)果表明，在中國石蒜10天幼苗中加蘭他敏、力克拉敏、石蒜堿的含量最低

6、。隨著生長時間的增加，生物堿含量增加。多年生的石蒜中生物堿含量最高。中國石蒜不同器官中生物堿含量積累規(guī)律研究表明：石蒜種仁、種皮以及根中生物堿含量較高，成熟種子中加蘭他敏含量最高(671.33μg/gDW)。葉片中生物堿的含量最少。
　　 3.分別以中國石蒜(Lycoris chinensis)的鱗莖、花序、種子為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，比較了不同的滅菌時間，不同的取材時間，不同的激素配比，不同的蔗糖濃度對中國石蒜污染率，誘導(dǎo)

7、率以及小鱗莖生長的影響。結(jié)果表明：鱗莖外植體用0.1％的氯化汞溶液滅菌12min污染率下降為32％，外植體成活率為96％，效果最好。不同的取材時間研究表明第一次休眠期（5～7月）取材較為合適。不同的激素配比實驗表明表明：MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L是最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，最高誘導(dǎo)率達到100％，平均再生芽數(shù)為8.5個；中國石蒜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.15～0.18mg/L+IBA1.5～1.0mg/

8、L。不同的蔗糖濃度對中國石蒜鱗莖生長的影響表明：小鱗莖的直徑的生長速度隨著蔗糖濃度的升高而加快，在蔗糖濃度為90g/L時，小鱗莖的直徑增加最大，為對照（蔗糖濃度為30g/L）的2.7倍；小鱗莖高度隨著蔗糖濃度的增加而減小。
　　 花序外植體用0.1％的氯化汞溶液滅菌13～14min污染率下降為57％～42％，外植體成活率為66％～54％，為較適宜的滅菌時間?；ㄐ虿煌瑫r期取材實驗表明，在盛花期取材較為合適。不同的激素配比實驗表明：

9、MS+6-BA5.0～7.0mg/L+NAA0.5mg/L為比較適宜的中國石蒜花序誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
　　 去皮后的中國石蒜種子較容易滅菌，在10min和11min的滅菌條件下的污染率為22％和19％，成活率為93％和94％。因此去皮后的中國石蒜種子在0.1％的氯化汞滅菌時間為10～11min為宜。把萌芽的種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L上，誘導(dǎo)率達98％。
　　 4.研究了中國石蒜的組

10、織培養(yǎng)的不同分化狀態(tài)對植株體內(nèi)加蘭他敏等生物堿含量的影響。愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS+2.0mg/L2，4-D+0.5mg/LBA，誘導(dǎo)率為95.27％，愈傷組織鮮重達到1.72g。分化培養(yǎng)基為MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L。本實驗結(jié)果表明，中國石蒜組織培養(yǎng)的分化狀態(tài)對生物堿的含量有很大影響，愈傷組織不含加蘭他敏，胚狀體和叢生芽中加蘭他敏、石蒜堿、力克拉敏的含量都低于三個月實生無菌種子苗中的含量。本研究還探討了

11、由中國石蒜鱗莖、花序、種子誘導(dǎo)出的叢生芽的生長速度以及對植株體內(nèi)加蘭他敏等生物堿含量的影響。結(jié)果表明，不同的外植體來源的叢生芽的生長狀況不同。由中國石蒜種子誘導(dǎo)的小鱗莖的直徑增加最大，為由鱗莖誘導(dǎo)的小鱗莖的1.65倍。但是由鱗莖誘導(dǎo)的叢生芽分化的小鱗莖的數(shù)量最多，為由種子誘導(dǎo)的小鱗莖數(shù)的2.7倍。來自花序的叢生芽中加蘭他敏的含量高于來自鱗莖和種子中加蘭他敏的含量，但都低于三個月無菌種子苗中的含量，也低于多年生植株中的含量。
　　

12、 5.采用生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子處理中國石蒜三個月的實生苗，考察其生物量和生物堿含量的變化情況。結(jié)果表明，甲基茉莉酸甲酯(MJ)在50、100、250μM處理時，以及水楊酸(SA)0.25、0.5、1.0mM濃度處理時，在對植物的生長有抑制作用，而酵母誘導(dǎo)物(YE)在0.05、0.10、0.15g/L時，一氧化氮(NO)在50、100、500μM處理時可以促進植物的生長。甲基茉莉酸甲酯(MJ)、一氧化氮(NO)和酵母誘導(dǎo)物(YE)可以

13、促進加蘭他敏的積累。在NO濃度為100pM處理10天的時候，加蘭他敏的含量提高的倍數(shù)最多為對照的1.72倍。在酵母誘導(dǎo)物(YE)的濃度為0.01g/L處理10天的時候，石蒜堿的含量提高最多為對照的1.38倍。
　　 6.克隆可能與加蘭他敏生物合成相關(guān)的兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）基因的片段。該基因的定量RT-PCR分析表明，在花、花葶、鱗莖和根中，加蘭他敏的含量與該部位COMT基因的表達量之間有一定的相關(guān)性，但并不完全一致。