紫球藻多糖的制備及其生物活性研究.pdf

1、紫球藻(Porphyrodium cruentum)是紅藻門中唯一的單細胞類群，在生長過程中能合成一類細胞外多糖(Extracellular polysaccharide，EPS)，其產量很大程度上受到培養(yǎng)條件的影響。國內外關于紫球藻的培養(yǎng)和活性成分的研究取得了一定進展，但有關紫球藻多糖分子修飾，尤其是在紫球藻多糖結構與其生物活性之間的關系研究方面尚不多見。本文采用生態(tài)調控和工藝培養(yǎng)條件優(yōu)化等手段，有效地提高了紫球藻多糖的產量，為紫球藻

2、多糖的大量制備奠定了良好的基礎。在紫球藻多糖理化性質研究和結構分析的基礎上，利用對多糖的降解和分子修飾等手段獲得了多種不同分子質量和不同硫酸基含量的多糖，并對這些不同性質多糖的抗氧化、抗腫瘤和免疫調節(jié)活性以及生物活性與分子結構之間的關系進行了詳細的研究，取得了以下研究結果： 1、提高紫球藻多糖產量的培養(yǎng)條件 (1)通過考察無機鹽、金屬離子及植物生長激素等對紫球藻多糖合成的影響，獲得了有利于提高多糖產量的培養(yǎng)基配方(OCM

3、II)：NaHCO33.5g，KH2PO420 mg，NaNO32 g，Na2SO420 mg，FeCl2·6H2O10μM，MnCl2·4H2O0.2μM，VB10.9 mg，VB122.7μg，無菌海水1000mL。采用OCMII培養(yǎng)基、15d培養(yǎng)，紫球藻多糖的最大產量達到了672 mg/L，分別比2/f和Koch對照培養(yǎng)基的多糖產量提高了1.79和1.62倍。 (2)在自行研制的平板式光生物反應器中，考察了光照密度、光照時

4、間、光質和反應器光徑對紫球藻多糖合成的影響。在光通量密度為80μE·m-2s-1、光暗循環(huán)周期為18:6、自然光照射條件下，多糖的產量達到0.96 g/L。在光徑為30 mm的反應器中多糖產量高達1.13 g/L，而在光徑為50 mm的反應器中多糖的面積產率最高達到5.80 g/m2/d的水平。 (3)采用均勻設計法對紫球藻半連續(xù)培養(yǎng)的工藝參數進行優(yōu)化。在NaNO3濃度、更新速率和更新周期分別為3.5 g/L、27％和2.91d

5、的優(yōu)化條件下，經過23d的培養(yǎng)，紫球藻多糖的總采收量達到29.4 g，平均多糖產量為1.96 g/L，分別是批式培養(yǎng)的2.35和1.57倍。 2、不同性質紫球藻多糖的制備及其結構性質分析 (1)利用DE52離子交換柱層析及Sephacryl S-400凝膠過濾柱層析獲得了純化的多糖。該多糖的平均分子量為2918 kDa，硫酸基含量14.63％，糖醛酸含量7.8％；多糖溶液為典型的假塑性流體特征，其粘度不受溫度、加熱時間等

6、的影響。GC分析表明該多糖由木糖、葡萄糖和半乳糖組成，為一種雜多糖，其摩爾比為：2.96:1.25:3.06；化學分析和光譜分析結果表明紫球藻多糖糖鏈連接方式以β-(1→3)為主，存在少量1→4及1←6糖苷鍵；Gal在支鏈或鏈末端有較大量的存在，Xyl和Glc在主鏈或靠近主鏈區(qū)域有特定分布。綜合上述分析，推斷EPS可能的重復單元結構如下： (2)采用密閉微波降解技術分別制備了相對分子量分別為6553 Da、60.66 kDa、和

7、256.26 kDa的小分子量多糖；采用超聲波輔助過氧化氫降解技術分別制備了203.6kDa、606.6 kDa、802.6 kDa、903.3 kDa和1002 kDa的小分子量多糖。通過控制不同的衍生溫度制備了硫酸根含量分別為31.0％、31.5％、47.5％和42.4％的硫酸酯多糖衍生物。降解后的小分子量多糖的理化性質沒有明顯的變化，衍生化后紫球藻多糖的水溶性明顯增加。 3、紫球藻多糖的生物學活性 (1)紫球藻多糖

8、的抗氧化活性所制備的各類紫球藻多糖均表現出很強的清除羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)自由基和1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)自由基的活性，并且清除作用均與其濃度正相關；對由Fe2+/抗壞血酸誘發(fā)的小鼠肝勻漿氧化損傷和由H2O2誘發(fā)的小鼠紅細胞氧化溶血也具有濃度依賴性的抑制作用。 多糖分子量對其抗氧化活性有顯著的影響，降解前原糖樣的抗氧化活性未能檢測出，但是降解后隨著多糖分子量的減小其抗氧化活性顯著增加，尤其是分子量

9、為6553Da的多糖的抗氧化效果最好。經過硫酸化修飾后，多糖的抗氧化活性明顯增加，對·OH和O2-·的半數抑制濃度分別為3.92 mg/mL和0.4mg/mL；隨著硫酸基含量的增加，衍生化多糖對三種自由基的清除效果明顯增強，但是差異不十分顯著。 (2)紫球藻多糖的抗腫瘤作用 SRB法測定紫球藻體外抗腫瘤活性，結果表明高分子量的紫球藻多糖沒有體外抑瘤效果，分子量為6.55 kDa和256 kDa的多糖對肺腺癌癌細胞(A549)和喉

10、表皮樣癌癌細胞(Hep-2)和肝癌細胞株(SMMC7721)表現出一定的抑制作用。 荷S180實體瘤小鼠灌胃給藥的結果顯示，高、中、低三個劑量組(200、100、50mg/kg/d)的紫球藻多糖均可顯著抑制S180實體瘤的生長，其抑瘤率分別為53.3％、47.5％和40.5％，表明該多糖具有明顯的抗腫瘤作用。并且紫球藻多糖能顯著地提高荷瘤小鼠的脾指數和胸腺指數，明顯促進脾淋巴細胞的增殖。在劑量為200μg/mL時，脾淋巴細胞的增

11、殖指數相對于模型組為2.41，相對于CTX陽性對照組為2.15。 (3)紫球藻多糖的體外免疫活性在25～200μg/mL濃度范圍內，紫球藻多糖能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO能力，增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力，促進小鼠腹腔巨噬細胞和脾淋巴細胞的增殖。分子量與硫酸基含量對免疫調節(jié)功能有顯著影響。分子量為6.55 kDa的多糖的免疫增強活性最強；除了硫酸基含量為32％的多糖對腹腔巨噬細胞的增殖促進作用最強外，其余都是隨著硫