雙胸蚓組織中一種核酸酶的純化及其底物特異性的研究.pdf

1、目的: 1.雙胸蚓組織中核酸酶粗提物的制備及核酸酶的純化。 2.核酸酶粗提物瓊脂糖凝膠測(cè)活體系的建立。 3.純化核酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究4.雙胸蚓組織核酸酶底物特異性的初步研究方法: 1.雙胸蚓組織中核酸酶粗提物的制備及核酸酶的純化以SDS-PAGE-DNA功能膠和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)活相結(jié)合作為雙胸蚓組織核酸酶提取過程中核酸酶活性的監(jiān)測(cè)體系。 以碳酸銨處理，熱變性，酸變性及丙酮沉淀后所得粗提物為起點(diǎn)，對(duì)

2、核酸酶依次進(jìn)行柱層析、電泳純化制備雙胸蚓核酸酶樣蛋白質(zhì)純品。 2.核酸酶粗提物瓊脂糖凝膠測(cè)活體系的建立以瓊脂糖凝膠電泳作為主要測(cè)活體系，研究核酸酶粗提物的最適反應(yīng)條件。 3.純化核酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究采用SDS-PAGE電泳法測(cè)定酶分子量，毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦電泳法測(cè)定酶等電點(diǎn)，酶活性測(cè)定等方法測(cè)定核酸酶的最適pH、最適溫度、溫度穩(wěn)定性、激動(dòng)劑、抑制劑，計(jì)算酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。 4.雙胸蚓組織核酸酶底物特異性的研究測(cè)定DNa

3、se E在最適反應(yīng)條件下對(duì)不同底物的降解速率，證明DNase E降解底物的選擇性；應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNase E水解雙鏈環(huán)狀DNA后的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，闡明DNaseE的水解方式。 結(jié)果: 1.雙胸蚓組織中核酸酶粗提物的制備及核酸酶的純化應(yīng)用本室建立的SDS-PAGE-DNA功能膠測(cè)活方法對(duì)核酸酶提取過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在提取過程中產(chǎn)生兩組核酸酶，在SDS-PAGE-DNA功能膠中遷移率較慢的一組采用碳酸銨處理+酸變性+熱變性

4、+丙酮沉淀的提取方法來獲得較好的層析樣品。樣品依次通過四步柱層析，PAGE-DNA功能膠純化得到電泳純的雙胸蚓核酸酶樣蛋白質(zhì)純品，命名為DNase E(Earthworm DNase)。 2.核酸酶粗提物瓊脂糖凝膠測(cè)活體系的建立以瓊脂糖凝膠電泳法作為主要測(cè)活手段，確定了2μl粒+10μl樣品，樣品溶于0.1MpH5.2NaAc(含20mM Mg2+)緩沖液，37℃共孵育30min后行瓊脂糖凝膠電泳的測(cè)活體系。 3.純化核

5、酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究對(duì)DNase E的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明其分子量約為32kDa，等電點(diǎn)為6.05左右，以小牛胸腺DNA為底物時(shí)，反應(yīng)的最適。pH值為5.2，最適溫度為42℃，其Km值為0.152mg/ml。20mM Mg2+，Ca2+，Mn2+對(duì)其活性有一定的激活作用，Zn2+，咪唑，EDTA，K+，Cu2+對(duì)其活性有一定的抑制作用，SDS-PAGE的結(jié)果表明DNase E為寡聚肽蛋白質(zhì)，它對(duì)酸、堿、有機(jī)溶劑穩(wěn)定。

6、4.雙胸蚓組織核酸酶底物特異性的研究通過DNase E在最適反應(yīng)條件下對(duì)幾種不同底物降解速率的研究表明DNase E降解底物存在差異性。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNase E水解雙鏈環(huán)狀DNA后的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，證明了DNaseE屬于核酸內(nèi)切酶。 結(jié)論： 1.確立了雙胸蚓組織核酸酶粗提液的制備工藝，通過柱層析及電泳純化的方法，獲得了一種核酸酶，命名為DNase E(電泳純)，分子量約為32kDa，等電點(diǎn)為6.05左右，反應(yīng)的最