雙胸蚓組織中一組核酸酶的分離、純化及其制備、純化工藝的研究.pdf

1、本室近年對雙胸蚓的研究發(fā)現(xiàn)，其組織內(nèi)含有非常強(qiáng)的能夠殺滅微生物、尤其是病毒的活性成分，并經(jīng)初步的研究表明，這些組分具有降解多種DNA和RNA的活性，推測應(yīng)是雙胸蚓組織中含有的核酸酶。為了進(jìn)一步確定雙胸蚓組織中核酸酶的種類、數(shù)量、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及作用機(jī)制，本研究從建立一系列靈敏、適用于各種特性的核酸酶樣品的活性測定方法入手，系統(tǒng)地研究了雙胸蚓組織核酸酶粗提液在各種理化條件下的穩(wěn)定性，并以此為依據(jù)，探索、研究了分離、純化雙胸蚓組

2、織核酸酶的技術(shù)路線，對雙胸蚓組織中多種核酸酶進(jìn)行了分離純化。 一、雙胸蚓組織核酸酶活性測定方法體系的建立鑒于本研究中的核酸酶的作用特征是能夠降解核酸(DNA和(或)RNA)，采用單相酶擴(kuò)散法、瓊脂糖凝膠電泳法、紫外分光光度法等技術(shù)，以DNA和RNA作為反應(yīng)底物，建立酶促反應(yīng)體系，通過分析底物的降解程度、降解方式，或者產(chǎn)物的增加(增色效應(yīng))，鑒定樣品中是否含有核酸酶及其活力大小，并推測可能的酶學(xué)機(jī)制。經(jīng)過長時間摸索和試驗，建立并確

3、定以下測活方法：1.單相酶擴(kuò)散法(SRED，平板法)；2.瓊脂糖凝膠電泳法；3.紫外分光光度法；4.PAGE-咪唑-氯化鋅反染技術(shù)；5.PAGE-DNA功能膠測活法；6.PAGE-考馬斯亮藍(lán)R-250染色比對切膠測活法；7.干瓊脂糖薄膜覆蓋法(DAFO)。 二、雙胸蚓組織核酸酶粗提液制備工藝和理化性質(zhì)的研究本部分研究采用瓊脂糖凝膠電泳、單相酶擴(kuò)散等方法對制備雙胸蚓組織粗提液過程中影響核酸酶活性的各種因素、粗提液的酸、堿穩(wěn)定性、溫

4、度穩(wěn)定性，PAGE、SDS-PAGE電泳過程中的理化因素對核酸酶活性的影響等進(jìn)行了研究。確定機(jī)械法為快速、有效的制備雙胸蚓組織勻漿的方法，以0.1mol/LNaAc/HAc(pH4.6)緩沖液作為抽提雙胸蚓組織勻漿中核酸酶的基本提取液。雙胸蚓組織核酸酶粗提液穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明：其最適pH范圍在4.0-5.4之間；粗提液中的核酸酶對溫度穩(wěn)定；無水乙醇、丙酮不破壞其中的核酸酶活性，并且在無水乙醇、丙酮含量達(dá)50％時，所有活性組分均進(jìn)入沉淀

5、中；55％硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)，含有較低的核酸酶活性，表明鹽析后活性組分主要保留在上清中。PAGE電泳過程中染色液、脫色液的主要成分甲醇、冰乙酸在工作濃度下對提取液中DNA酶活性有輕微的抑制作用，但染色液中的考馬斯亮藍(lán)，可完全抑制DNA酶活性。此外，1％的SDS可完全抑制該酶活性。 三、雙胸蚓核酸酶層析純化方案的研究本部分研究以雙胸蚓組織核酸酶粗提液為起點(diǎn)，研究了常壓層析包括分子篩和陰離子交換層析；高壓層析包括高壓陰離子交換、疏水

6、、反相和陽離子交換用于純化雙胸蚓核酸酶的效果，最終確定常壓DEAE后過分子篩或高壓CM柱的層析路線，得到的層析峰濃縮后可以方便的用于PAGE電泳純化。并在研究過程中探索了幾種有效的蛋白質(zhì)濃縮方法包括層析柱濃縮、超濾和有機(jī)溶劑沉淀。 四、雙胸蚓核酸酶電泳純化方案的研究及10種不同分子量核酸酶的確定在層析純化的基礎(chǔ)上，采用PAGE，SDS-PAGE，2D-PAGE，PAGE-DNA功能膠，結(jié)合咪唑-氯化鋅反染色技術(shù)，從蚯蚓組織中純化

7、并確定了3種DNA酶，分別命名為EWD1(157kDa)、EWD2(69.1kDa)、EWD3(62.6kDa)，純度為電泳純；7種核酸酶EWN1(EarthwormNuclease1)、EWN2(EarthwormNuclease2)、EWN3(EarthwormNuclease3)、EWN4(EarthwormNuclease4)、EWN5(EarthwormNuclease5)、EWN6(EarthwormNuclease6)、E

8、WN7(EarthwormNuclease7)，純度為層析純。并用多種核酸酶活性分析技術(shù)對以上各酶進(jìn)行了活性確定。通過PAGE-DNA功能膠新發(fā)現(xiàn)了10種不同分子量的核酸酶。 五、存在的問題及進(jìn)一步分離純化方案的設(shè)計分析了目前純化方案存在的問題，并設(shè)計了進(jìn)一步的分離純化方案：采用新型高壓層析填料、親和層析的應(yīng)用、不同濃度樣品采用不同的方案，最終得到具有活性的單一蛋白成分。 結(jié)論1.成功建立了一系列適合于不同條件、靈敏的核