蚯蚓組織中一組核酸酶酶學(xué)、生物學(xué)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、蚯蚓(Earthworm)在中醫(yī)藥中對(duì)感染性疾病的藥學(xué)、臨床學(xué)的醫(yī)治效果以及對(duì)蚯蚓組織提取物抗病毒作用研究的結(jié)果均提示，蚯蚓組織中存在著由多種因子組成的、能夠抑制、降解微生物和單細(xì)胞生物的分子系統(tǒng)，各分子相互協(xié)同，完成蚯蚓以微生物為食的消化、吸收功能。核酸酶類是這一分子體系中的一類必須的組成元件，其作用不僅與其消化作用有關(guān)，還是一種通過(guò)降解遺傳物質(zhì)，殺滅微生物的有效機(jī)制。 國(guó)內(nèi)外對(duì)核酸酶的生物學(xué)意義研究甚少，結(jié)論也不甚明確，目前

2、尚未見(jiàn)核酸酶與免疫及固有免疫、抗病毒等的系列研究報(bào)道。值得注意的是，以往的研究中證實(shí)了核酸酶在已發(fā)現(xiàn)的各種動(dòng)物消化道中大量存在的事實(shí)，但均習(xí)慣性地認(rèn)為與核酸的消化吸收有關(guān)。這一觀點(diǎn)與體內(nèi)的核苷酸代謝和核酸代謝相矛盾。因?yàn)樵诮^大多數(shù)的動(dòng)物體內(nèi)，核苷酸的合成原料并不依賴消化道的吸收來(lái)提供，而是以氨基酸及其代謝產(chǎn)物為主要原料的“從頭合成”和“補(bǔ)救合成”途徑來(lái)滿足機(jī)體的需要。營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究也不支持這種觀點(diǎn)，因?yàn)楹塑账峒捌浯x產(chǎn)物均不是人體的必需營(yíng)

3、養(yǎng)素。那么消化道中種類如此齊全、活性很強(qiáng)的核酸酶應(yīng)該還有其他重要的生物學(xué)意義，比如清除食物中的核酸、防止外源基因侵入、擬或殺滅病毒和微生物。原核生物中的限制性酶體系支持這種假設(shè)，它的基因“免疫”系統(tǒng)在保證遺傳穩(wěn)定性方面有著重要價(jià)值。 近年來(lái)對(duì)核酸酶與免疫系統(tǒng)的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，核酸酶在各種免疫細(xì)胞中有著廣泛的分布和極高的活性，提示其與固有免疫有著密切的關(guān)系。為了進(jìn)一步證實(shí)蚯蚓組織中核酸酶的種類、數(shù)量、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以

4、及生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，探索核酸酶在以微生物為食的多種生物中存在的普遍性、該酶類與免疫系統(tǒng)降解內(nèi)、外源廢棄細(xì)胞和微生物機(jī)制的關(guān)系，本文選擇蚯蚓作為研究模型，分四部分對(duì)蚯蚓組織中多種核酸酶進(jìn)行了分離純化、理化性質(zhì)和酶學(xué)性質(zhì)研究，初步探索多種低等生物和免疫細(xì)胞中核酸酶的活性、數(shù)量和分布。各部分研究結(jié)果分別簡(jiǎn)述如下： 一、蚯蚓組織核酸酶(EWDs和EWNs)的分離、純化 采用酶學(xué)、蛋白質(zhì)研究技術(shù)和核酸酶分析技術(shù)，首先對(duì)蚯蚓組

5、織核酸酶粗提液與提取、純化相關(guān)的理化、酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并用常壓、高效色譜系統(tǒng)研究了蚯蚓組織中具有核酸酶活性的各組分的層析行為和條件，確定了本文中酸性條件、有機(jī)溶劑和等電點(diǎn)沉淀的提取方案和陰離子、陽(yáng)離子交換串聯(lián)層析結(jié)合PAGE電泳的高效、經(jīng)濟(jì)的純化技術(shù)路線，并用多種核酸酶活性分析技術(shù)對(duì)以上各酶進(jìn)行了活性確定。結(jié)果表明，蚯蚓組織中存在3種DNA酶，分別命名為EWD<,1>(157kDa)、EWD<,2>(69.1kDa)、 EWD<,3

6、>(62.6kDa)，純度為電泳純： 5種核酸酶EWNl(EarthWorm Nuclease 1)、EWN<,2>(Earthworm Nuclease 2)、EWN<,3>(EarthwormNuclease 3)、EWN4(Earthworm Nuclease 4)、EWN<,5>(Earthworm Nuclease 5)，純度為層析純。以上發(fā)現(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究為證明蚯蚓組織中核酸酶多樣性提供了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為進(jìn)一步的酶學(xué)

7、、結(jié)構(gòu)、功能等研究提供了高純度的樣品，奠定了基礎(chǔ)。 二、蚯蚓組織中核酸酶(EWDs和EWNs)酶動(dòng)力學(xué)、性質(zhì)和影響酶活性因素的研究 本部分研究采用Sephacryl-200柱層析、SDS-PAGE電泳、MALDI-TOF三種方法確定了EWD<,1>、EWD<,2>、EWD<,3>的分子量分別為157kDa、69.1kDa、62.6kDa。明顯大于已發(fā)現(xiàn)的DNase Ⅰ和DNaseⅡ。對(duì)EWDs和EWNs進(jìn)行了溫度穩(wěn)定性、

8、pH穩(wěn)定性、激動(dòng)劑、抑制劑研究，給出了各影響因素的參數(shù)，這些參數(shù)與已發(fā)現(xiàn)的各種DNases相比較有明顯差別。但三種EWDs的酶學(xué)性質(zhì)極為相似，理化性質(zhì)穩(wěn)定。酶動(dòng)力學(xué)研究表明，三種EWDs的Km值分別為1.58、3.95和1.52mg/ml，表明EWD<,2>活性>EWD<,3>>EWD<,3>。EWNs具有RNA酶活性，其活性不依賴于Mg<'2+>、Ca<'2+>、Mn<'2+>等。以上結(jié)果提示，蚯蚓組織中已發(fā)現(xiàn)的核酸酶EWDs、EWN

9、s具有特殊的酶學(xué)特征。其作用機(jī)理和分類有待于進(jìn)一步的研究和歸類。 三、蚯蚓組織核酸酶(EWDs和EWNs)作用機(jī)制的研究 本部分采用ZORBAX-Oligo柱-HPLC、瓊脂糖電泳、紫外分光光度法等分析技術(shù)，進(jìn)行了EWDs、EWNs對(duì)環(huán)狀、線狀DNA、單鏈DNA的降解中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的觀察和分析。結(jié)果表明，EWDs、EWNs對(duì)所有的形式的DNA底物均有降解作用，降解產(chǎn)物為較均一的、<18bp的寡核苷酸，各酶的降解終產(chǎn)物無(wú)

10、明顯長(zhǎng)度差異。EWNs同時(shí)還具有降解RNA底物的作用，EWDs無(wú)此作用。結(jié)果提示，EWDs為脫氧核糖核酸內(nèi)切酶類(DNases)，EWNs為非特異性核酸酶(Nucleases)。 四、雙胸蚓組織中核酸酶的生物學(xué)作用及其機(jī)制的研究 用瓊脂糖電泳DNA酶活性測(cè)定法研究了與蚯蚓生活習(xí)性相近的幾種低等生物組織提取液中核酸酶的活性分布；同時(shí)研究了幾種主要的免疫細(xì)胞中DNA酶的活性分布情況，結(jié)果表明，紅線蟲(chóng)、水蚤、黃粉蟲(chóng)等低等生物的

11、組織提取液中，含有高活性的DNA酶。研究的幾種免疫細(xì)胞中，包括白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中均存在大量的、高活性的核酸酶。 結(jié)論： 1.建立了分離、純化蚯蚓組織核酸酶的技術(shù)路線，并分離出3種DNA酶，分別名為EWD<,1>(157kDa)、EWD<,2>(69.1kDa)、EWD<,3>(62.6kDa)，純度為電泳純； 5種核酸酶EWNl(Earthworm Nuclease 1)、EWN2(Earthworm Nucl

12、ease 2)、EWN<,3> (Earthworm Nuclease 3)、 EWN<,4> (Earthworm Nuclease 4)、 EWN<,5>(Earthworm Nuclease 5)，純度為層析純； 2.對(duì)蚯蚓組織中核酸酶(EWDs和EWNs)酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和影響酶活性因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，蚯蚓組織純化的三種DNA酶(EWD<,1>、EWD<,2>、EWD<,3>)的分子量分別為157 kDa、69.1 k

13、Da和62.6 kDa，作用底物是DNA，包括雙鏈DNA、單鏈DNA、環(huán)狀DNA和線狀DNA，最適pH值在4.0～5.6之間，對(duì)溫度較為敏感，55℃時(shí)，失去DNA酶活性，Mn<'2+>、Ca<'2+>為其活性抑制劑，Mg<'2+>對(duì)酶的活性無(wú)明顯影響； 3.首次用采用ZORBAX-Oligo柱-HPLC等分析技術(shù)對(duì)EWDs、EWNs的底物特異性和降解行為進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，EWDs、EWNs對(duì)所有的形式的DNA底物均有降解作用