釀酒酵母氧化應(yīng)激反應(yīng)中一組氧化還原酶的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、活性氧(reactive oxygen speices，ROS)是由細(xì)胞正常的有氧代謝產(chǎn)生或因暴露于誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生的化合物，如超氧陰離子(·O<,2><'->)、過(guò)氧化氫(H<,2>O<,2>)及羥自由基(·OH)。當(dāng)這些物質(zhì)積累到一定的濃度時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA)發(fā)生氧化變性、交聯(lián)或斷裂，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，甚至造成細(xì)胞的死亡。釀酒酵母擁有酶系和非酶系抗氧化系統(tǒng)來(lái)清除細(xì)胞內(nèi)的自由基，并維持細(xì)胞內(nèi)正

2、常的還原狀態(tài)。其中還原過(guò)氧化氫的最主要的兩個(gè)途徑分別為谷氧還蛋白系統(tǒng)(NADPH-Glr1-GSH-Grx)和硫氧還蛋白系統(tǒng)(NADPH-Trr1/2-Trx-Prx)。我們分別表達(dá)純化了這兩個(gè)系統(tǒng)中的部分蛋白，并通過(guò)蛋白質(zhì)晶體學(xué)和體外生化實(shí)驗(yàn)來(lái)研究其結(jié)構(gòu)和功能上的相互關(guān)系，從而幫助我們構(gòu)建氧化應(yīng)激條件下蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。 我們解析了釀酒酵母谷胱甘肽還原酶Glr1的氧化態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)大腸桿菌、人和酵母谷胱甘肽還原酶同源

3、結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，三者皆為同二聚體，整體結(jié)構(gòu)比較一致，且活性位點(diǎn)殘基高度保守，但在二聚體相互作用界面上存在著較大的差異。Glr1蛋白表面的半胱氨酸Cys239被谷胱甘肽修飾(glutathionylation)。盡管這一修飾并沒(méi)有對(duì)局部結(jié)構(gòu)造成影響，但是Cys239位于底物GSSG進(jìn)入通道的附近，這里同時(shí)也是其還原產(chǎn)物GSH的離開(kāi)通道；同時(shí)谷胱甘肽化也是蛋白保護(hù)自由巰基或調(diào)節(jié)酶活的方式之一，因此這一位置的谷胱甘肽化對(duì)于蛋白活性的維持可能有

4、一定的作用。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)Glr1中位于電子供體NADPH進(jìn)入位點(diǎn)附近的Asn278被糖基化修飾，形成約20個(gè)糖基的寡糖鏈。我們通過(guò)體外酶活實(shí)驗(yàn)鑒定了重組表達(dá)蛋白和天然蛋白的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，確定了Asn278的糖基化降低了蛋白的催化活性。 對(duì)釀酒酵母谷氧還蛋白Grxl氧化型和谷胱甘肽化型結(jié)構(gòu)的分析表明，伴隨Cys27和Cys30之間二硫鍵的斷裂，活性位點(diǎn)CPYC附近的殘基發(fā)生了較大的構(gòu)象變化。同時(shí)我們根據(jù)谷胱甘肽化的Grx1的結(jié)

5、構(gòu)揭示了其GSH結(jié)合相關(guān)的重要氨基酸殘基以及它們?cè)诜€(wěn)定結(jié)合的谷胱甘肽分子中所起到的作用。釀酒酵母Grx1和Grx2雖然同屬于雙巰基谷氧還蛋白亞家族，其活性位點(diǎn)同為CPYC，兩者之間的氨基酸序列一致性也高達(dá)64％，但是兩者在各自缺陷菌株的現(xiàn)象卻各不相同。通過(guò)Grx2氧化型和還原型兩種晶體結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)Grx2由于氧化還原狀態(tài)的不同所導(dǎo)致的構(gòu)象變化與Grx1中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象變化相類似。而在對(duì)Grx1谷胱甘肽化型結(jié)構(gòu)和Grx2還原型結(jié)構(gòu)的比較中我

6、們發(fā)現(xiàn)，位于谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)的γ-谷氨酸一端與Grx1的Asp89之間形成較強(qiáng)的相互作用，而在Grx2中相應(yīng)的位點(diǎn)變成Ser123，導(dǎo)致γ-谷氨酸一端與Grx2之間相互作用的削弱，從而降低GSH的結(jié)合能力，并進(jìn)一步通過(guò)ITC實(shí)驗(yàn)證明Grx1對(duì)GSH的親和力要明顯高于Grx2。Grx1位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，而Grx2位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。不同的細(xì)胞定位存在這不同的氧化還原環(huán)境，尤其是GSH的濃度上的差異。而正是Grx1和Grx2對(duì)于GSH的

7、親和力的不同，導(dǎo)致了兩者在細(xì)胞中生理作用的差異。我們還解析了釀酒酵母烷基過(guò)氧化物還原酶Ahp1氧化型的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其在一個(gè)非對(duì)稱單位中以同二聚體的形式存在，并形成了Cys31和另一個(gè)亞基中Cys62形成分子間的二硫鍵，同時(shí)其二聚體相互作用界面垂直于中心的β-sheet。但之前的文獻(xiàn)報(bào)道稱Ahp1在催化反應(yīng)中應(yīng)形成了Cys62與另一個(gè)亞基的Cys120的分子間二硫鍵，這與我們解析的晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)果相沖突。于是我們進(jìn)一步構(gòu)建了Ahp1的C

8、31S，C62S和C120S三個(gè)突變體，并檢測(cè)其分子間二硫鍵的形成以及體外生化活性，并證實(shí)了我們的結(jié)果，即具催化活性半胱氨酸殘基為Cys31和Cys62，而非Cys120。 文獻(xiàn)報(bào)道Ahp1被泛素相關(guān)修飾蛋白Urm1共價(jià)修飾。由于Ahp1在氧化應(yīng)激反應(yīng)中在還原細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物中起到重要的作用，這表明Urm1修飾體系在氧化應(yīng)激中可能起到一定的調(diào)控作用。為此我們解析了Urm1的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其整體結(jié)構(gòu)與其溶液結(jié)構(gòu)基本一致，不同在于其