偶氮還原酶AZR的結(jié)構(gòu)模型與功能研究.pdf

1、近年來(lái)偶氮染料的生物降解受到廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)分離并考察了眾多可脫色偶氮染料的微生物，純化并研究了多種具有偶氮還原酶活性的蛋白質(zhì)，但對(duì)于偶氮還原酶的結(jié)構(gòu)與功能缺乏深入認(rèn)識(shí)。本論文對(duì)細(xì)菌脫色偶氮染料的能力，細(xì)菌FMN依賴型偶氮還原酶的結(jié)構(gòu)模型與功能等展開研究。
　　 考察沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352細(xì)胞及其細(xì)胞提取物脫色偶氮染料的能力。對(duì)于生長(zhǎng)過(guò)程中的R.palustr

2、is ASl.2352，在靜置缺氧條件下，可在17 h內(nèi)脫色80％以上活性艷紅X-3B(50 mg L-1)。細(xì)菌在30-35℃和pH6-9具有較高脫色能力。脫色速率與染料初始濃度間可用米門方程描述，Vmax和Km分別為65 mg gcell-1 h-1和978 mg L-1。其細(xì)胞提取物具有偶氮還原酶活性，脫色速率遠(yuǎn)高于未破碎的細(xì)菌細(xì)胞。對(duì)比考察兩株光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides AS1.1737，R.palu

3、stris AS1.2352和基因工程菌Escherichia coli YB靜止期早期細(xì)胞脫色含磺酸取代基的偶氮染料的能力。光合細(xì)菌表現(xiàn)出較基因工程菌更強(qiáng)的脫色能力。R.sphaeroides AS1.1737，R.palustrisAS1.2352和Ecoli YB的Vmax/Km值分別為0.2，0.15和0.06 L g cell-1 h-1。兩株光合細(xì)菌具有較好的脫色混合染料的能力，E coli YB脫色混合染料的效果不佳。

4、r>　　 利用同源建模方法建立了R，sphaeroides AS1.1737的偶氮還原酶AZR的結(jié)構(gòu)模型。AZR的單體具有類似黃素氧化還原蛋白的α/β型結(jié)構(gòu)，五個(gè)相互平行的β-折疊位于分子中央形成一個(gè)平面，五個(gè)α-螺旋分別位于平面兩側(cè)，一側(cè)兩個(gè)，另一側(cè)三個(gè)；分子中結(jié)合的FMN輔基可能作為氧化還原反應(yīng)中電子傳遞的中介。盡管依序列可將FMN依賴型偶氮還原酶歸為兩個(gè)家族，但它們的單體都具有類似黃素氧化還原蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　 利用

5、NAD(P)H提供電子，AZR可還原多種硝基化合物。以硝基呋喃為底物，AZR硝基還原酶的最適pH=7，最適溫度為50℃。NADPH為更適合的輔酶，反應(yīng)遵循雙底物乒乓動(dòng)力學(xué)機(jī)理。比較AZR對(duì)2，4，6-三硝基甲苯(TNT)、2，4-二硝基甲苯(2，4-DNT)、2，6-二硝基甲苯(2，6-DNT)等幾種多硝基取代甲苯的還原發(fā)現(xiàn)，TNT為最適底物；2，4-DNT比2，6-DNT更適合降解。經(jīng)HPLC/MS檢測(cè)，TNT的還原產(chǎn)物可能為羥胺二硝

6、基甲苯。AZR能遵循雙底物乒乓動(dòng)力學(xué)機(jī)理還原外加FMN。NADPH和FMN的米氏常數(shù)分別為0.5和14.2 mM，Vmax為172.4μmol mg protein-1 min-1；外加FMN抑制AZR的偶氮還原酶和硝基還原酶活性，是NADPH、甲基紅和硝基呋喃的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制常數(shù)Ki分別為1.7、2.3和6.4μM。AZR具有廣泛的底物范圍，不但可以還原偶氮化合物、硝基化合物和FMN等有機(jī)物，還可以還原鐵氰化鉀和重鉻酸鉀等無(wú)機(jī)底物

7、，是一種新的硝基/FMN還原酶家族的成員。
　　 在序列對(duì)齊分析和結(jié)構(gòu)模型分析的基礎(chǔ)上，選擇AZR分子中FMN輔基附近兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的Tyr74、His75和Lys109等氨基酸位點(diǎn)，利用多次PCR的方法進(jìn)行了K109A，K109H，Y74W和H75N等定點(diǎn)突變研究。利用E coli異源表達(dá)并純化幾種突變型AZR。對(duì)比考察野生型與突變型AZR的活性。以酸性紅B為底物，野生型AZR的最適pH為7-8，K109H和H75N的最適pH

8、=6，而K109A和Y74W的最適pH=9。突變的引入可能改變了AZR分子表面的電荷情況，從而改變了其最適pH。與野生型AZR相比，幾種突變型AZR的酶活都出現(xiàn)下降，表明Y74、H75和K109對(duì)酶活有重要影響。分析底物結(jié)合常數(shù)表明，Y74W和H75N突變對(duì)NADPH的結(jié)合無(wú)影響，而只影響AZR對(duì)甲基紅和硝基呋喃的結(jié)合；H75N突變后AZR完全喪失硝基還原酶活性。第109位氨基酸荷正電對(duì)甲基紅的結(jié)合有重要影響，而對(duì)硝基呋喃的結(jié)合無(wú)影響；

9、K109H對(duì)NADPH的結(jié)合并非保守突變，其結(jié)合不僅需要該處荷正電，可能還與空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。K109可能只參與對(duì)NADPH的2’-磷酸基團(tuán)的結(jié)合，而對(duì)NADH的結(jié)合無(wú)影響。
　　 自然界中天然存在的偶氮類和硝基類芳香化合物并不常見，因此還原酶AZR可能具有其他功能。醌類化合物廣泛存在于自然界和各種生物體的代謝過(guò)程中。AZR與來(lái)自不同域的醌還原酶的氨基酸序列中都較為保守地存在一段40-50個(gè)氨基酸構(gòu)成的參與結(jié)合底物與輔酶的序列。AZ

10、R與醌還原酶NQ01的單體具有類似的α/β型結(jié)構(gòu)(rmsd=9.5 A，467 atoms)和黃素輔基結(jié)合方式。AZR具有醌還原酶活性，遵循乒乓機(jī)理，可還原甲萘醌、2.羥基-1，4-萘醌(LQ)、葸醌-2-磺酸和葸醌-2，6-二磺酸等萘醌和葸醌化合物，甲萘醌為最適底物，而對(duì)1，4-苯醌無(wú)活性。與偶氮和硝基化合物相比，醌類化合物為AZR更適合的底物。雙香豆素抑制AZR的醌還原酶活性，為NADPH的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制常數(shù)K1=87.6pM。

11、胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)的醌還原酶AZR提高了E coli YB對(duì)氧化應(yīng)激的耐受。在H2O2、甲萘醌、百草枯等應(yīng)激源存在條件下和經(jīng)熱休克處理后，Ecoli YB的存活率都高于對(duì)照株E coli JM109。氧化還原介體LQ的加入可提升Ecoli JM109和E coliYB培養(yǎng)物脫色偶氮染料的能力。E coil YB的介導(dǎo)脫色能力較E coli JM109更為突出；在0.2 mM LQ存在下，E.coli YB2 h內(nèi)可脫色75％的莧菜紅(1mM)